Volumetrika a proteomika u shuntovaného normálního tlakového hydrocefalu (LiNPH)

POZADÍ & SHRNUTÍ POPIS PROJEKTU

Idiopatický normální tlak hydrocefalus (=iNPH) je stav s narušenou cerebrální dynamikou způsobující symptomy v podobě poruch rovnováhy a chůze, inkontinence a kognitivní poruchy u pacientů s dilatací mozkových komor. Tento stav je mnohem častější, než je obecně známo, s prevalencí, která se prudce zvyšuje s věkem, z 2,1 % ve věku 70 let na 8,9 % ve věku nad 80 let. Adams a Hakim popsali onemocnění již v roce 1965 na základě symptomatologie a reverzibility symptomů po odběru CSF. Až v roce 2005 však vyšla kompilace doporučených postupů pro diagnostiku a léčbu onemocnění založených na důkazech, Mezinárodní směrnice iNPH. Bylo konstatováno, že v současné době kromě tap-testu CSF neexistuje žádný spolehlivý prediktivní test pravděpodobnosti reakce pacienta na shunting. Existuje několik různých škál pro hodnocení závažnosti onemocnění, jednou z nich je škála iNPH se subškálami chůze, rovnováha, neuropsychologie a kontinence.

Na Neurochirurgické (NK) a Neurologické (NL) Fakultní nemocnice Linköping funguje od roku 2004 dobře fungující multiprofesionální tým. Tým vyšetřuje a léčí iNPH na základě doporučení pocházejících z jihovýchodní zdravotnické oblasti Švédska. Ročně je přijato přibližně 250 doporučení, je hodnoceno 70-80 pacientů a nejméně 40 pacientů je operováno s ventrikuloperitoneálním zkratem. Hodnocení spočívá v první fázi radiologických vyšetření, klinickém posouzení neurologem, následuje motorické posouzení fyzioterapeutem a kognitivní posouzení ergoterapeutem. Obvykle se provádějí tap-testy CSF, při kterých je lumbální punkcí odvedeno až 50 ml mozkomíšního moku, což u iNPH obvykle zmírňuje příznaky. Součástí hodnocení je také videozáznam pohybového vzorce kvalitativního hodnocení. Výsledky spolu s radiologickým vyšetřením jsou zváženy společně a poté tým, pokud má být pacientovi nabídnuta léčba. Pacienti jsou operováni s ventrikuloperitoneálním zkratem na NK a sledováni v NL stejnými motorickými a kognitivními testy tři měsíce po operaci, po kterých jsou výsledky vyhodnoceny. Ve větších studiích se pooperačně zlepšilo přibližně 70 % pacientů s iNPH, kteří dostali zkrat.

Shuntová terapie je jedinou léčbou iNPH a je dostupná od 50. let 20. století. Cílem léčby je snížit množství mozkomíšního moku v komorovém systému a tím normalizovat objem v komorovém systému. Od počátku 90. let se stále častěji používají nastavitelné směšovací ventily. To znamená, že chlopeň lze v případě potřeby upravit po implantaci externím magnetem přiloženým na místo chlopně. Nevýhodou většiny nastavitelných ventilů je, že nastavení ventilu lze nechtěně upravit při vystavení silným magnetickým polím, například pokud pacient podstoupí vyšetření magnetickou kamerou. Nastavitelné ventily však přinášejí mnoho výhod, protože odpor lze přizpůsobit potřebám pacienta i po operaci. Například jednu z nejčastějších komplikací po shuntu (subdurální hematom) lze často léčit zvýšením odporu chlopně. V roce 2015 společnost Codman Johnson & Johnson představila nový shunt ventil, Certas Plus, což je nastavitelný shunt s osmi různými nastaveními. Chlopeň je zavedena v klinické praxi. Zvláštností je nejvyšší nastavení (8), což je 40 cm H20, což je velmi vysoký odpor, který by teoreticky měl odpovídat vypnutému bočníku a je firmou nazýván „virtuální vypnutí“. Je také navržen tak, aby byl odolný vůči MR, a proto při vystavení magnetickému poli MRI nemění nastavení. Tyto vlastnosti byly dosud testovány in vitro, ale dosud nebyly provedeny žádné klinické studie. Výhodou těchto funkcí je potenciálně méně chirurgických zákroků a lůžkové péče a také umožňuje pacientům v jihovýchodním zdravotnickém regionu provádět plánovaná a akutní MRI vyšetření v jejich domovské nemocnici, aniž by museli chodit na neurochirurgické oddělení v Linköpingu kvůli přestavbě chlopně.

Komorová dilatace je radiologická diagnóza. Od 40. let 20. století se měří největší průměr mezi laterálními hranicemi postranních komor a největší biparietální průměr na vnitřní straně lebky, aby se získal takzvaný Evansův index dělením obou a získáním poměru. Je snadno měřitelná, ale je to metoda s mnoha zdroji chyb a špatnou citlivostí na změny objemu v komorovém systému. Existuje potřeba spolehlivější metody jak v klinické praxi, tak ve výzkumu. Volumetrie, tedy měření objemu komor, se stala stále více používanou metodou, která se však dosud v klinické praxi neprosadila z důvodu časově náročného ručního výpočtu. Pomocí MRI snímků, které jsou převedeny ve speciálním softwaru (ITK-SNAP), lze vypočítat objem a vykreslit trojrozměrný obraz komorového systému. Několik studií v literatuře studovalo vztah mezi odporem bočníkových chlopní a snížením objemu komor. Neexistují žádné prospektivní zaslepené studie studující změnu komorového objemu související s shuntovou terapií, shuntovou rezistencí, ani neexistují žádné studie o tom, zda existuje korelace mezi redukcí komorového objemu a pooperačním klinickým výsledkem. Studijní skupina v Uppsale nedávno publikovala studii o pacientech s shuntovaným iNPH, kde nová MRI technologie vyvinutá v Linköpingu (SyntheticMR) jasně může ukázat, jak se objem komor po léčbě zmenšuje, aniž by se změnil Evansův index. Ve stejné studii bylo také možné ukázat, jak se po shuntu zřetelně mění další parametr v komorách, tzv. kalosální úhel. Toto je část radiologické hodnotící škály, Radscale, kterou lze aplikovat na tuto skupinu pacientů. Stejná výzkumná skupina již dříve dokázala pomocí SyntheticMR ukázat, jak se komorový objem zmenšuje po tap testech u pacientů s iNPH, aby se do 24 hodin vrátil do původního stavu. CMIV (=Centrum pro lékařské zobrazování a vizualizaci) v americkém Linköpingu má několik MR kamer Univerzitní nemocnice 3 Tesla a dobré technologické a vědecké znalosti o SyntheticMR, protože metoda se tam vyvíjí. Pomocí krátkého MRI protokolu (6 minut) vytváří kvantitativní údaje o stavu mozkové tkáně, což usnadňuje zjištění, co je šedá a bílá mozková hmota, podpůrný protein mozkových buněk myelin a také mozkomíšní mok, a vypočítává objem každé složky. Sekvence se standardními protokoly pro hydrocefalus, včetně sekvencí DTI (=Diffusion Tensor Imaging) vyžadují dalších 15–20 minut v kameře MRI. SyntheticMR dokáže také jako dosud jediná metoda snadno vypočítat objem CSF, který se nachází mimo komory v bazálních cisternách a mozkových sulcích. Objemy extracerebrálního CSF ​​ve zdravém mozku ani v iNPH však zatím nikdo nezkoumal. Navíc nikdo nezkoumal, jak se tento objem extracerebrálního CSF ​​mění v reakci na shunting.

Proteom je souhrnný název proteinů, které organismus nebo orgán syntetizuje. Proteom není konstantní, ale mění se mezi různými orgány ve stejném organismu a ve stejném orgánu v průběhu času a změn v nemocném organismu nebo orgánu. Proteomika je věda o těchto proteinech a lze ji použít ke zkoumání, kdy a kde lze určité proteiny nalézt, jejich koncentrace, jak se rozkládají, modifikují a jak interagují v různých fyziologických a chorobných procesech. Některá neurologická onemocnění byla charakterizována svými proteomickými změnami, jako je esenciální třes a chronická neuropatická bolest, členy naší výzkumné skupiny. Proteomika mozkomíšního moku u pacientů s iNPH je relativně neprozkoumaná, pouze tři studie v literatuře. Ty charakterizovaly několik proteinů, které vynikají ve srovnání s tím, co se očekává ve zdravém mozku. Nebyly provedeny žádné srovnávací studie mezi CSF odebraným lumbální punkcí a mozkomíšním mokem z komor. Na klinice bolesti a rehabilitace ve Fakultní nemocnici Linköping je zřízena proteomická laboratoř (PAINOMICS lab) s mnoha vědeckými publikacemi. Standardními metodami dostupnými pro proteomické studie jsou dvourozměrná gelová elektroforéza (2D elektroforéza) a hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS). Ty se používají k analýze až tisíce proteinů v jednom vzorku a pomocí technologie založené na protilátkách je validují. Pomocí technologie založené na protilátkách lze také analyzovat až 86 cytokinů, chemokinů, růstových faktorů a metabolických látek v takzvaném multiplexním panelu. Soubory dat získané v proteomických studiích jsou složité. Tyto datové soubory se skládají z mnoha a vysoce korelovaných proměnných (koncentrace proteinů). Poté lze porovnat změny obsahu proteinů mezi pacienty s iNPH a kontrolami a stanovit rozdíl v "otisku prstu" proteomu. Existuje velká potřeba nových biomarkerů jako doplňku k aktuálně dostupným metodám pro stanovení definitivní diagnózy, posouzení pravděpodobnosti úspěchu terapie a vytvoření hlubšího porozumění patofyziologii iNPH.

CÍLE, VĚDECKÉ OTÁZKY A PODSTUDIE:

1. Vyhodnoťte a ověřte klinicky užitečnou metodu monitorování komorových objemů pomocí syntetické MRI. Srovnání se zavedenou volumetrickou metodou (ITK-SNAP) a pro spolehlivost v rámci a mezi posuzovateli.
2. Zmapujte komorové objemy a množství extracerebrálního intrakraniálního CSF ​​za normálních fyziologických podmínek u zdravých kontrolních osob a pacientů s INPH a vypočítejte, jak se tyto objemy mění po provedení zkratu v INPH.
3. Zkoumejte, jak objemová změna a změna volumetrie a iNPH Radscale po shuntu korelují s klinickým výsledkem 3 měsíce po operaci.
4. Prověřte funkci a bezpečnost shuntu CERTAS PLUS z hlediska odolnosti vůči MR in vivo a korelujte míru snížení objemu komory na základě odporu chlopně.
5. Zmapujte proteomickou expresi iNPH v CSF a krevní plazmě před operací a sledujte změnu 3, 12 a 36 měsíců po ventrikuloperitoneálním zkratu.
6. Porovnejte, jak se liší proteomika v CSF u iNPH mezi lumbálním a ventrikulárním CSF a krevní plazmou. Zjistěte, zda se bederní CSF pacientů s iNPH liší ve srovnání s neurologicky zdravými kontrolními osobami stejného věku a pacienty s esenciálním třesem.

PROJEKTOVÝ PLÁN, REALIZACE A VÝBĚR OBJEKTŮ VÝZKUMU:

Švédská národní rada pro etiku (Etikprövningsmyndigheten), ref. č. 2020-0071920, schválila tento projektový plán.

Do studie je postupně přijímáno 50 pacientů, kteří podstoupili vyšetření týmu NPH a jsou považováni za vhodné pro shuntovou léčbu.

Kontrolní skupina sestávající z 50 dobrovolníků starších 60 let je rekrutována prostřednictvím čekací listiny na operace na odděleních ortopedie, urologie a gynekologie ve Fakultní nemocnici Linköping. Dobrovolníci se budou rekrutovat ze starších pacientů, kteří při plánované ortopedické/gynekologické/urologické operaci ve spinální anestezii podstoupí lumbální punkci pro aplikaci anestezie. Dobrovolníci předoperačně podstoupí vyšetření magnetickou rezonancí včetně standardních sekvencí i protokolů SyntheticMR pro volumetrii.

Předoperační vyšetření pacientů s iNPH týmem NPH sestává z následujících vyšetření: 1. Klinické posouzení neurologem. 2. Rovnováhu a schopnost chůze posuzuje fyzioterapeut. Testy zahrnují Timed Up and Go (TUG), počet kroků a čas, stejně jako stupnici chůze, stupnici rovnováhy a 10 m chůze jako součást stupnice iNPH. 3. Ergoterapeut hodnotí kognitivní funkce a provádí tyto testy: MMSE (=Mini-Mental State Examination), Grooved pegboard, Reyův sluchový verbální test učení, Stroopovo pojmenování barev a Stroopova interference, Trail Making Test A a B. 4. Odhad inkontinence moči se provádí na stupnici inkontinence moči. Všechna hodnocení jsou kombinována ve škále iNPH.

Součástí základního vyšetření je lumbální punkce s měřením intratekálního tlaku, analýzou buněk, proteinu, protilátek proti lymské borelióze a likvorovým tap-testem. V týmu NPH se prodiskutuje pacientova anamnéza, symptomy a výsledky z radiologie a mozkomíšního tap-testu, aby se rozhodlo, zda je pacient považován za vhodného pro zkrat.

Pacienti, kterým tým doporučil posun a nesplňují kritéria pro vyloučení ze studie, jsou povoláni na ambulantní návštěvu k Dr. Rafaelu Holmgrenovi, jsou informováni o zamýšlené operaci a souvisejících rizicích a po ústní a písemné informaci jim je nabídnuta účast ve studii. Pacientům je nabídnut čas na rozmyšlenou a vrátit se k telefonu kontaktní sestry, než odpoví.

Dobrovolníci v kontrolní skupině jsou rekrutováni mezi pacienty, u kterých je plánována operace ve spinální anestezii na odděleních ortopedie, urologie a gynekologie Fakultní nemocnice v Linköpingu. O případné účasti ve studii jsou kromě písemných informací informováni ústně telefonicky nebo na přání během ambulantní konzultace s Dr. Rafaelem Holmgrenem. Účastníci kontrolní skupiny podstoupí před operací MRI vyšetření se standardním protokolem a syntetickou MRI. Před podáním spinální anestezie se odebere 10 ml lumbálního CSF ​​pro analýzu proteomického profilu, stejně jako vzorek krve pro stejný účel.

Zúčastnění pacienti s iNPH, kteří mají být shuntováni, podstoupí den před operací MRI s upraveným standardním protokolem a syntetickou MR; potřebný čas je asi 45 minut.

Pacienti jsou následující den v celkové anestezii a je provedena lumbální punkce, po které je odebráno 10 ml mozkomíšního moku. Současně je také odebrán vzorek krve pro proteomickou analýzu. Pacient je operován s ventrikuloperitoneálním zkratem standardním postupem jedním ze tří chirurgů (Dr. Rafael Holmgren, Dr. Peter Zsigmond nebo Dr. Martin Nilsson v NK). Pacienti dostávají bočníkový ventil Codman CERTAS PLUS s jedním ze dvou nastavení ventilu zaslepeným pro operátora, pacienta a radiologické vyšetřovatele (nastaveno jiným kolegou v souladu s randomizací): 4 (=110 mm H20, konvenční výchozí nastavení) nebo 8 (> 400 mm H20 a k a "virtuální vypnutí"). Protože jsou mozkové komory propíchnuty katetrem, je zde odebráno dalších 10 ml CSF pro proteomiku. Vzorky jsou transportovány do proteomické laboratoře, centrifugovány, rozděleny na malé alikvoty před zmrazením. Poté jsou uloženy v biobance v pracovním a environmentálním lékařství ve fakultní nemocnici v Linköpingu (registrované u National Board of Health and Welfare). Každému příchozímu subjektu je přidělen jedinečný kód a tímto číslem jsou označeny všechny zkumavky. Kódový klíč je uložen v zamčené skříni na neurochirurgické klinice v Linköpingu.

Přibližně 36 hodin (rozmezí 24-48 hodin) po operaci pacient podstoupí nové MRI vyšetření pomocí SyntheticMR a po tomto vyšetření se zkontroluje nastavení ventilu pomocí kompasu čtečky přiloženého nad ventilem. Pacienti, kteří původně dostávali nastavení chlopně 8, jsou nyní nastaveni na standardní nastavení 4, pokud po operaci neutrpěli subdurální hematom, který je pooperačně detekován při MRI vyšetření. Pacient je poté propuštěn buď domů, nebo do místní nemocnice. Všichni pacienti se tak vracejí domů s fungující shuntovou léčbou.

Pacienti jsou po třech měsících povoláni zpět ke standardnímu sledování u pacientů s shuntovanou iNPH na zpáteční návštěvu u chirurga a provedou klinické vyšetření/sledování fyzioterapeutem a ergoterapeutem se stejným protokolem pro motorické a kognitivní testy jako před operací. Pacienti absolvují také nové MRI vyšetření se stejným protokolem jako před operací. Nastavení směšovacího ventilu se zkontroluje po MRI, aby se potvrdilo, že nastavení ventilu je stejné jako předtím. Také komora shuntu se za sterilních podmínek propíchne malou jehlou, aby se získalo 10 ml CSF z komor, a také se odebere vzorek krve pro proteomickou analýzu.

Pacienti jsou po jednom a třech letech od operace voláni zpět k operačnímu lékaři ke klinickému posouzení a nové punkci shuntu a krevním testům stejným postupem jako při 3měsíční kontrole.

Všechny komplikace spojené se zkratem, včetně úprav odporu zkratu v souvislosti s MRI, jsou průběžně registrovány.

Testy vzorků CSF a krve provádí profesor Bijar Ghafouri v laboratoři Painomics s hmotnostní spektrometrií a 2D elektroforézou pro identifikaci, separaci proteinů a techniky ELISA pro jejich charakterizaci. Identita vzorku je pro zkoušejícího zaslepena.

Studie MRI jsou analyzovány ve specifickém softwaru upraveném pro hodnocení objemů ve studiích provedených jak konvenční technologií (ITK SNAP), tak technologií SyntheticMR od Dr. Holmgrena a Dr. Georgiopoulose. Identita pacienta a nastavení zkratu jsou pro vyšetřující zaslepeny, stejně jako načasování studie.

STATISTICKÝ ZÁKLAD PRO VELIKOST STUDOVANÉ POPULACE

Počet padesáti pacientů s iNPH je posouzen jako adekvátní k naplnění stanovených cílů projektu. Je tomu tak proto, že studie proteomiky na iNPH (Chen et al a Li et al, viz odkazy) zahrnovaly 18 a 15 pacientů, v daném pořadí, a získaly jasné statisticky významné výsledky. Studie komorového objemu vypočtené pomocí syntetické MRI po lumbální punkci a shuntu provedené Virhammarem et al zahrnovaly 23 a 18 pacientů a poskytly jasné statisticky významné výsledky. Počet neurologicky zdravých kontrolních subjektů/dobrovolníků v kontrolní skupině je 50, což odpovídá počtu pacientů s INPH.