Účinky řízeného cvičení na starší obyvatele komunity

Design Institucionální revizní rada nemocnice pro terciární péči schválila studii (IRB č.: 201602058A3C502 a NCT04839796). Od května do listopadu 2021 byla provedena randomizovaná kontrolovaná studie s posuzovatelem a zaslepenou studií účinků cvičebních režimů na stárnoucí osoby. Všechny subjekty poskytly informovaný souhlas po pochopení experimentálních postupů. Účastníci byli poté náhodně rozděleni, aby podstoupili 30minutový trénink pod dohledem (SET) při středně intenzivním kontinuálním tréninku (MICT) po dobu 24 sezení ve skupinách nemocničního nebo domácího cvičení (HET) pomocí počítačem generovaného skrytého rozvrhu přidělování. Data byla shromážděna zaslepeným hodnotitelem před randomizací a po dokončení cvičení.

Účastníci byli dotazováni jednotlivci žijící v komunitě ve věku >=55 let, kteří žili v sousedství komunitní nemocnice. Byli přijati starší dospělí se skóre mini-mental state exam (MMSE) > 24 a negativní bederní páteří a také s degenerativním onemocněním kloubů dolních končetin. Ti, kteří měli nestabilní klinické projevy uvedené v našich předchozích studiích, nebo sarkopenie, diagnostikovanou na základě doporučení Asijské pracovní skupiny pro sarkopenii, nebyli kandidáty studie. Vyloučili jsme také jedince s absolutní kontraindikací pro aerobní aktivity, jak navrhuje American College of Sports Medicine (ACSM). Základní skóre fyzické složky (PCS) a skóre mentální složky (MCS) ve studii Medical Outcomes Short Form 36 (SF-36) byly použity k posouzení kvality života (QoL) a byly přehodnoceny 24 týdnů po náboru. Základní demografické charakteristiky a klinické informace zahrnutých účastníků byly pečlivě zaznamenány.

Cvičení Trénink Všichni účastníci byli instruováni, aby nosili chytré hodinky (WDI08, WisDat Inc., Taichung, Taiwan) a udělali alespoň 8000 kroků za den (stp/d). Kromě 8000 stp/d podstoupili účastníci SET 24 sezení pod dohledem MICT (70 % maximální předpokládané HR) po dobu 30 minut na cyklistickém ergometru (Ergoselect 150P, ergoline GmbH, Bitz, Německo) v naší nemocnici během 8. - týdenní období. Všem subjektům bylo telefonicky a prostřednictvím aplikace připomenuto, aby během prvních 8 týdnů po náboru každý týden užívali >=8000 stp/d. Po dokončení MICT byli účastníci SET instruováni, aby užívali >=8000 stp/d po dobu dalších 16 týdnů. Účastníci HET byli instruováni, aby užívali 8000 stp/d po dobu 24týdenního sledování. V posledních 16 týdnech nebyl ve všech předmětech připomenut pokyn k odběru >=8000 d/d. Cvičení bylo ukončeno, když subjekt měl symptomy/znaky během cvičení podle směrnice ACSM.20 Měření fyzické zdatnosti Chytré hodinky nošené na zápěstí (WDI08, Wisdat Inc., Taichung, Tchaj-wan) zaznamenávaly každodenní počet kroků a energetický výdej u každého subjektu a průměrný počet kroků a energetický výdej (Kcal) za den v roce týden představoval průměrné denní kroky a energetický výdej za týden v komunitě během 24týdenního období sledování.

Obvod lýtka (Calf_circ) byl získán zprůměrováním největšího Calf_circu u bilaterálních nohou. Inteligentní analýza pohybu (eFitHealth, uCare Medical Electronics, Co. Ltd., Miaoli, Tchaj-wan) s využitím interaktivních hlasů a 3D hloubkových obrazových průvodců k posouzení 2minutového počtu kroků, 5násobného trvání sezení a vstávání a sezení a sezení na židli. -dosahová vzdálenost (doplňkové údaje 1). Každý z výše uvedených testů byl použit k odhadu VO2max (eV O2max), svalové síly dolních končetin a flexibility. Bylo měřeno složení těla, včetně celkové tělesné vody (TBW), minerálních látek, množství bílkovin (Prot), svalové hmoty (LBM), hmoty kosterního svalstva (SKM), hmoty tělesného tuku (BFM) a bazálního metabolismu (BMR). vícefrekvenční bioimpedanční analýzou (Inbody 720, Inbody Co., Ltd., CA, USA). Výše uvedená měření byla dokumentována před, 8 týdnů po a 24 týdnů po úvodní návštěvě.

Extrakce RNA Odběr krve 10 ml celé krve od každého subjektu při náboru, 8 týdnů a 24 týdnů od počáteční návštěvy, byl umístěn do zkumavky obsahující 3,2 % citrát sodný. Vzorky byly poté odstřeďovány při 360 x g po dobu 15 minut, přičemž supernatant byl dále odstřeďován při 2400 x g po dobu 20 minut při teplotě místnosti 25 °C, aby se počet krevních destiček v plazmě udržel pod 2,5 x 10^8/ml. Zpracovaná plazma o objemu 400 mikrol byla umístěna do 2ml eppendorfu (Eppendorf corp. Hamburk, Německo) pro smíchání s 1200 mikroL TRIzolu (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) a 5 mikroL miR-39 (5x10^-15 mol/mikroL), exogenní kontrola, C. elegans a také 2 mikrog (10 mikrog/ml v plazmě) kvasinkovou RNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Bylo přidáno dalších 320 mikroL chloroformu a umístěno při teplotě místnosti na 5 minut. Vzorek byl odstřeďován při 12 000 xg po dobu 15 minut při 4 °C a 300 mikroL bezbarvé tekuté vrstvy bylo odsáto, aby bylo smícháno s 900 mikroL ledového 100% ethanolu přes noc při -80 °C. Připravený vzorek byl umístěn do kolony Direct-zol (Direct-zol RNA Miniprep, Zymo Research corp., Irvine, CA, USA) a poté byl centrifugován při 12000 xg po dobu 30 sekund. Kolona byla poté přenesena do nové sběrné zkumavky a byla centrifugována při 12000 xg po dobu 30 sekund po smíchání se 400 mikroL promývacího pufru RNA. Reakční směs DNázy I 80 ul (enzym DNáza I 5 ul + pufr štěpení DNA 75 ul) byla přidána do zkumavky po odstranění promývacího pufru RNA a byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Do zkumavky bylo přidáno dalších 400 mikrol pufru pro předběžné promytí a bylo centrifugováno při 12 000 xg po dobu 30 sekund. Kolona byla poté přenesena do nové 1,5 ml zkumavky bez RNázy a byla ošetřena 80 mikroL vody bez nukleázy při teplotě místnosti po dobu 2 minut. Připravený vzorek byl centrifugován při 12000 xg po dobu 2 minut, aby se eluoval roztok RNA.

Byla analyzována kvantifikace hladin plazmatické mikroRNA hladin miR-21, miR-126, miR-146a a miR-222 ve výše uvedených třech různých časech. Jednokroková kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-qPCR) byla provedena za použití systému RT-qPCR (T100TM Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories Inc., Berkeley, CA, USA) k posouzení hladin plazmatické mikroRNA. Směs 100 ng celkové RNA extrakce, 10 mikrol TaqMan master mix (ThermoFisher), 5,8 mikroL vody bez nukleázy, 0,2 mikrol univerzální knihovny sond 21 (10 mikroM), 0,1 mikrol inhibitoru RNázy, samokonstruované 1 mikrol dopředné primery a 1 microL reverzní primery pro miR-39, miR-126 a miR-146a a templát 2 mikroL cDNA byly vytvořeny na ledu. Všechny reakce byly inkubovány na 48jamkové destičce při 95 °C po dobu 3 minut, následovalo 40 cyklů 95 °C po dobu 5 sekund, 60 °C po dobu 10 sekund a 72 °C po dobu 1 sekundy. Samostatně vytvořené sekvence dopředných a reverzních primerů pro primární miR-39 C. elegans (C-miR-39) jako exogenní kontrola. Lidské miR-126 (miR-126) a miR-146a (miR-146a) (doplňková tabulka 1) byly normalizovány exogenní kontrolou a byly použity ke stanovení exprese hladin mikroRNA během sledování.

Ke stanovení lidských miR-21 (miR-21) a miR-222 (miR-222) byl použit kit miRCURY LNA SYBR Green PCR (Qiagen). Směs 4 mikrol 5X miRCURY RT SYBR Green Reaction Buffer, 2 mikrol 10X miRCURY RT Wnzyme Mix a 14 mikrol 100 ng celkové RNA extrakce ve vodě bez nukleázy byla inkubována na 48jamkové destičce při 42 °C po dobu 60 minut a následuje 95 °C pro vytvoření cDNA. Směs obsahující 2 mikrol primerů C-miR-39 (nebo miR-21/ nebo miR-222) zakoupených od Qiagen, 10 mikrol miRCURY SYBR Green Master Mix, 2 mikrol vody bez nukleázy a 6 mikrol 5X generovaného cDNA templátu byla inkubována při 95 °C po dobu 2 minut, následuje 40 cyklů 95 °C po dobu 10 sekund a 56 °C po dobu 60 sekund. has-miR-21 a hsa-miR-222 byly normalizovány pomocí C-miR-39 a byly použity ke stanovení exprese hladin mikroRNA během sledování.

Stanovení zánětlivé aktivity 300 mikroL séra bylo naředěno v poměru 1:2. Na testovací destičku (Multiplex Human Cytokine Panel 1, Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA) naneste 50 mikroL připravených vzorků na jamku a kalibrátory v duplikátech. Každá jamka obsahující protilátky zachytila ​​IL-la, IL-lp, IL-6, IL-10 a TNFa. Směs, která obsahuje biotinylované protilátky specifické pro analyt, se přidá po vymytí veškerého nenavázaného proteinu. Biotinylované protilátky doplnily sendvič pro každý specifický uspořádaný analyt. Po odmytí nenavázané biotinylované protilátky se přidá streptavidinová křenová peroxidáza (SHRP). Po dalším promytí je množství SHRP zbývající na každém místě čipu úměrné množství výše původně zachycených cytokinů. Množství konjugovaného enzymu na každém místě čipu se měří s přidáním chemiluminiscenčního substrátu.

Statistická analýza Data jsou prezentována jako průměr (95% CI) nebo n (%). Rozdíly spojitých a nominálních parametrů a mezi oběma skupinami byly odhadnuty pomocí student-t a chí-kvadrát testů. Opakované měření ANOVA byla provedena pro analýzu rozdílů kontinuálních parametrů měřených ve třech časových bodech v každé skupině. Pro zjištění vztahu mezi fyzickou zdatností a miRNA byla provedena Pearsonova korelace. Za statistickou významnost byla považována hodnota p menší než 0,05.