Epidemiologie Parkinsonovy choroby v Chorvatsku a vliv genetických faktorů a mikrobioty na progresi a výsledky léčby nemoci (GiOPARK) (GiOPARK)

Parkinsonova nemoc (PD) je druhé nejčastější neurodegenerativní onemocnění, které postihuje 2–3 % běžné populace nad 65 let. Existují významné rozdíly ve výskytu v závislosti na geografické poloze, rase a etnickém původu. Přesná příčina onemocnění je stále neznámá, ale role genetických a environmentálních faktorů již byla stanovena. Určité genetické formy onemocnění tvoří malé procento, proto se má za to, že na vznik onemocnění mají významnější vliv faktory prostředí. Výskyt PD je vyšší u lidí vystavených významnému množství pesticidů a traumatickému poranění mozku, zatímco u kuřáků a lidí konzumujících významnější množství kofeinu je výskyt nižší.

Kromě toho je střevní a orální mikrobiota považována za významný faktor v patogenezi onemocnění, a to kvůli zjištěné květinové nerovnováze u lidí trpících PD. V tuto chvíli není známo, zda onemocnění předchází dysbióza střevní mikrobioty, nebo je to důsledek narušené neuronální komunikace osy játra-mozek. Vzhledem k tomu, že v Chorvatsku dosud nebyla provedena řádná epidemiologická studie, neexistují žádné znalosti o počtu případů PD spojených s genetickými a environmentálními faktory, díky čemuž je tento projekt vědecky a společensky přínosnější.

Specifickou patofyziologickou událostí u PD je ztráta neuronů v substantia nigra spolu s akumulací intracelulárního proteinu α-synukleinu v celém centrálním nervovém systému. Je důležité poznamenat, že PD je asymptomatická po delší dobu, protože symptomy se začnou projevovat až při ztrátě více než 70-80 % dopaminergních neuronů. Dysfunkce gliových buněk, buněk, které jsou obvykle odpovědné za udržování homeostatických podmínek v centrálním nervovém systému, doprovází PD. Dysfunkce vede k neurozánětu a mikrogliální aktivaci, fagocytóze a destrukci neuronů. Na druhé straně chybí řádná nutriční a reparační reakce astrocytů, gliových buněk zapojených do neuroprotekce a opravy poranění v CNS. Bohužel stále není znám žádný specifický biomarker pro PD, nicméně změny neurodegenerativních, nutričních a imunologických markerů u těchto poruch umožňují experimentální sledování progrese onemocnění. Nedávné výzkumy navrhly souvislost mezi střevní mikroflórou a gliovými buňkami ve fyziologických podmínkách, ale také v patogenezi různých neurodegenerativních poruch. V současnosti se má za to, že k prvním patofyziologickým změnám dochází uvnitř střevního nervového systému, který je v přímém kontaktu se střevní mikroflórou. Střevní mikrobiota by tak mohla modulovat patogenezi PD a přispívat k interindividuální variabilitě klinického obrazu. I když se malý počet studií zaměřil na tuto část patogeneze onemocnění, skutečný vliv dysbiózy střevní a orální mikroflóry na patogenezi PD není prokázán. Také nebyly provedeny žádné studie, které by zkoumaly vztah mezi genetickými a environmentálními faktory, takže prospektivní studie s de novo pacienty s PD jsou nezbytné pro osvětlování středních účinků dysbiózy na progresi onemocnění a výsledek léčby.

Projekt skončí za čtyři roky, přičemž prvních 20 měsíců bude věnováno první fázi (geneticko-epidemiologický výzkum) a celých 48 měsíců druhé fázi projektu (prospektivní klinický výzkum) Účastníci: Výzkumná skupina v první fáze výzkumu zahrnuje pacienty s PD v celé Chorvatské republice. Populace by zahrnovala všechny dostupné postižené v současnosti žijící v Chorvatsku, kteří jsou členy nebo spolupracují s chorvatským sdružením pacientů s PD. Odhadovaná odpověď je 10 % populace PD (500-750 pacientů). Pacienti vyplní epidemiologické dotazníky a budou vybráni pacienti s familiární PD. Očekávaný výskyt hereditární formy onemocnění v populaci PD se pohybuje kolem 10-15 % (50-75). Druhá fáze výzkumu (prospektivní klinická studie) zahrnuje dvě předmětové skupiny. První budou tvořit pacienti z Klinických nemocničních center v Rijece, kteří dosud nebyli aktivně léčeni (naivní), zatímco druhou budou tvořit zdravé kontroly ve stejném věkovém rozmezí. Cílový počet subjektů v obou těchto dvou skupinách je 50. Kritériem pro zařazení pacientů dosud neléčených je potvrzená diagnóza PD podle klinických diagnostických kritérií společnosti Movement Disorder Society. Zdravá kontrolní skupina se bude skládat z účastníků ze stejné věkové skupiny se stejným nutričním stavem (index tělesné hmotnosti) a také žijících ve stejné zeměpisné oblasti jako testovací skupina. Kritéria vyloučení pro účast zahrnují jedinečné dietní plány, chronické onemocnění střev, jakékoli autoimunitní onemocnění, akutní infekční onemocnění, akutní aktivní zánět, anamnéza pacienta s pozitivním nálezem významných gastrointestinálních chirurgických zákroků a aktivní antibiotikum, probiotika, doplněk výživy, kortikosteroidy a imunosupresiva.

První fáze – geneticko-epidemiologická studie (20 měsíců): Během prvních devíti měsíců budou v celém Chorvatsku náborováni účastníci, kteří jsou členy nebo spolupracují s chorvatským sdružením pacientů s PD. Na konci prvního roku výzkumu budou účastníci sekvenovat celé své exomy pomocí sekvenování nové generace (NGS), aby našli genetické varianty u chorvatských pacientů. Během druhého roku výzkumu je plánována analýza a šíření výsledků a také poradenství pro účastníky s potvrzenou familiární variantou onemocnění. Za tímto účelem budou účastníci dávat vzorky krve na genetickou analýzu. Cílový počet subjektů v této fázi výzkumu je 50. Účastníci budou také požádáni o vyplnění několika strukturovaných studijních formulářů, které by měly poskytnout odhad genetického pozadí účastníka spolu s informacemi o jeho biorytmu, spánkových vzorcích, stravě, životních cílech a obecném stresu.

Druhá fáze – prospektivní klinická studie (48 měsíců): Výběr účastníků bude probíhat během prvního roku klinické studie. Pro kontrolní návštěvy jsou vybrány následující časové intervaly: výchozí stav; 6 měsíců, 12 měsíců, 24 měsíců a 30 měsíců. Analýza výsledků a jejich šíření jsou plánovány na poslední dva roky výzkumu. Každý účastník studie bude mít svůj exom sekvenovaný pomocí NGS se zaměřením převážně na části, které mají známý dopad na patogenezi PD. Jak u pacientů, tak u zdravé kontrolní populace bude také stanoveno jejich složení mikrobioty pomocí NGS a také jejich funkční stav pomocí analýzy složení mastných kyselin s krátkým řetězcem, známých metabolických produktů mikrobioty. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) bude použita k posouzení zánětlivého stavu, gliových funkcí a progrese onemocnění bude také určena prostřednictvím specifických markerů ve vzorcích séra a plazmy účastníka. Fluorescenční korelační spektroskopie (FCS), konkrétněji fluorescenční analýza s fluktuující intenzitou thioflavinu T (ThT) (FIFA) bude použita ke stanovení existence patologických konformačních proteinových forem a jejich vztahu ke stupni onemocnění a terapii. Právě u těchto metod budou účastníci požádáni, aby poskytli vzorek krve, stolice a slin. Progrese onemocnění bude také sledována pomocí transkraniální B-mod sonografie a magnetické rezonance mozku.

Sekvenování exomu bude provedeno na základní linii, zatímco analýza složení a funkce mikrobioty bude provedena při první a poslední kontrolní návštěvě. Při každém kontrolním vyšetření bude provedena analýza biomarkerů, analýza konformace proteinů a neuroradiologické metody. Od první návštěvy budou účastníci požádáni o vyplnění několika strukturovaných studijních dotazníků, které poskytnou odhad genetického pozadí účastníka spolu s informacemi o jeho biorytmu, spánkových vzorcích, stravě, životních cílech a celkovém stresu. Kromě toho bude kognitivní stav účastníků hodnocen prostřednictvím validovaných testů, jako je Mini-Mental State Examination (MMSE) a Montreal Cognitive Assessment (MoCA), zatímco obecné nemotorické symptomy budou hodnoceny pomocí testu Non-Mental State Examination. Dotazník motorických příznaků (NMSQ) a škála nemotorických příznaků (NMSS). Pacienti budou také hodnoceni pomocí UPDRS (Unified Parkinson's disease rating scale), nejvýraznější škály v PD.

Hlavním cílem první fáze projektu je zjistit, které genetické mutace jsou nejvíce zastoupeny v chorvatské populaci postižené familiární formou PD. Ve druhé fázi je hlavním cílem zjistit vliv genetických faktorů a mikrobiologických faktorů na progresi onemocnění i na výsledky léčby. Specifickými cíli této části projektu je zjistit, kolik pacientů v obecné populaci pacientů s PD má genetickou poruchu a které geny se na této poruše podílejí, a také určit složení střevní a orální mikroflóry jak v testovací skupina pacientů a zdravá kontrolní skupina. Specifickými cíli je dále zhodnotit účinky standardní léčby PD na složení mikrobioty, progresi neurodegenerace a aktivitu neurozánětu v CNS a prozkoumat, zda existuje souvislost mezi fyziologickou a patofyziologickou funkcí mikrobioty, pomocí markerů progrese onemocnění a gliová aktivita. Posledním specifickým cílem je analyzovat potenciální patologické konformační proteinové formy, které by mohly být použity jako biomarker v časných stádiích onemocnění a biomarker progrese onemocnění.

První fáze studie poskytne první epidemiologická data o familiární formě PD a také o mutacích nejvíce zastoupených u pacientů s PD v Chorvatsku. Kromě toho prospektivní klinická studie přispěje k objasnění vzájemně provázaných účinků genetických a environmentálních faktorů na vznik a progresi onemocnění, stejně jako jejich vliv na výsledek léčby. Analýza složení střevní a orální mikrobioty určí, zda existuje rozdíl mezi PD a zdravou populací, zatímco použití profilu mastných kyselin s krátkým řetězcem určí metabolické rozdíly mezi těmito dvěma skupinami. Analýza markerů homeostázy CNS, zánětu a neurogliální funkce určí progresi onemocnění a také je koreluje s genetickými faktory a také s funkcí a složením mikroflóry. Analýza patologických konformačních forem alfa-synukleinu by mohla vést k objevu nových biomarkerů v raných stádiích onemocnění a také ke sledování progrese onemocnění.