Validace molekulárního testu pro stratifikaci rizika u pacientů s vysoce rizikovou střevní metaplazií (studie GCEP2)

Cíle:

Hlavním cílem této studie je zjistit, zda může přizpůsobený molekulární test prospektivně identifikovat u pacientů s intestinální metaplazií (IM) podskupinu pacientů s velmi vysokým rizikem dysplazie nebo karcinomu žaludku (GC). Sekundárními cíli této studie je ověřit prediktivní hodnotu panelu krevních mikroRNA biomarkerů pro predikci rizika GC, stejně jako určit přesnost detekce infekce Helicobacter pylori pomocí sekvenování nové generace a porovnat ji se současnou zlatý standard, močovinový dechový test.

Studovat design:

Mezinárodní, multicentrická kohorta pro hodnocení klinické užitečnosti přizpůsobeného molekulárního testu k identifikaci podskupiny pacientů s IM s velmi vysokým rizikem GC. Cílový nábor je 500 subjektů s IM OLGIM fáze 2 až 4.

Vzhledem k tomu, že aktualizovaný protokol biopsie Sydney není rutinně prováděn pro klinické účely a většina subjektů bude přijata před potvrzením jejich OLGIM stadia na začátku, někteří jedinci budou ze studie vyřazeni, pokud se zjistí, že nemají žádnou IM, nebo budou IM hodnoceni jako IM. OLGIM Stádium 1, na základní linii OGD.

Od spolupracujících míst se požaduje, aby poskytly následující vzorky s přidruženými demografickými a klinicko-patologickými údaji (jak je uvedeno ve formuláři zprávy o případu): Zmražená tkáň a tkáň FFPE z místa antra pro extrakci DNA, sérum pro test na protilátky H. pylori a profilování miRNA a buffy coat pro extrakci DNA.

Zápis:

Pacienti, které vyšetřovatelé viděli během klinik, budou zváženi pro zařazení.

Aby se minimalizoval počet subjektů, které byly vyřazeny po základní endoskopii kvůli selhání detekce alespoň 2. až 4. fáze OLGIM na začátku, mohou být pro nábor upřednostněni pacienti s anamnézou středně těžké nebo těžké IM buď v antru nebo v těle.

Základní linie:

1. Dotazník Subjekty budou požádány o vyplnění základního dotazníku, který poskytne informace o demografii, osobní zdravotní anamnéze, životním stylu a rodinné anamnéze GC. Klinická data a identifikátory budou zaznamenány.
2. Urea Breath Test Subjekty budou 6 hodin nebo přes noc hladovět, než podstoupí dechový test s močovinou (UBT). Sběr dechu bude proveden před požitím 13C močoviny a za 10 minut, 20 minut a 30 minut po požití.
3. OGD a biopsie

Subjekty podstoupí základní OGD pod vysokým rozlišením bílého světla (1080p) a biopsii pro zjištění stavu OLGIM. Videozáznam OGD bude proveden během procedury pro validaci diagnózy. Biopsie žaludeční sliznice budou odebrány následovně:

• Každá 1 biopsie z AL, AG, IA, BL, BG podle Updated Sydney System bude fixována ve 4% paraformaldehydu (PFA) a odeslána k histologickému vyšetření
• 2 sousední biopsie v AL a 2 sousední biopsie v BL budou bleskově zmraženy v tekutém dusíku

Místa jsou definována takto:

• AL - menší zakřivení antra, do 2-3 cm od pyloru
• AG - větší zakřivení antra, do 2-3cm od pyloru
• IA - incisura angularis
• BL - menší zakřivení korpusu, 4 cm proximálně od angulu
• BG - střední část většího zakřivení korpusu, 8 cm od kardie

Pokud endoskopista zpozoruje oblasti podezřelé z IM v antru a/nebo korpusu, které se nacházejí ve výše definovaných umístěních aktualizovaného systému Sydney, pak by měly být odebrány biopsie pro histologické vyšetření a také 2 sousední zmrazené biopsie z těchto oblastí s podezřením na IM. namísto.

Pokud endoskopista zpozoruje podezřelé oblasti IM v antru a/nebo korpusu, které jsou mimo výše definovaná umístění aktualizovaného systému Sydney, měly by být místo toho odebrány 2 sousední zmrazené biopsie z těchto podezřelých oblastí IM.

Všechny slizniční léze identifikované během OGD budou v rámci běžné klinické praxe odděleny biopsií a odeslány k histopatologickému posouzení.

Zmrazené vzorky biopsie budou uloženy ve vysoce kvalitní tkáňové bance.

Vyšetřovatelé se budou řídit výše uvedeným protokolem. Mohou se však odchýlit od protokolu, pokud to vyžadují zájmy pacienta.

Odběr, zpracování a analýzy krve:

Každému subjektu bude odebráno 20 ml krve. Bude extrahováno sérum, plazma a buffy coat.

Histologické vyšetření:

Všechny bioptické vzorky budou hodnoceny na stupeň chronické gastritidy, atrofické gastritidy, přítomnost organismů H. pylori, IM a dysplazii. Ty budou hodnoceny pomocí aktualizovaného systému Sydney. Přítomnost IM je indikována přítomností globetových buněk na základě barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) nebo pozitivní expresí Alciánovou modří (AB) a bude klasifikována na mírnou, střední a výraznou. Dysplazie bude klasifikována podle revidované vídeňské klasifikace a klasifikace karcinomu bude podle klasifikace nádorů WHO a stagingového systému AJCC. Pro odvození stadia OLGIM bude hodnoceno procento žaludeční epiteliální sliznice vykazující znaky IM v biopsiích.

Molekulární test:

Tři hlavní genomové změny – zvýšené frekvence mutací, somatické změny počtu kopií (sCNA) a zkrácení telomer – byly již dříve stanoveny, aby ukázaly asociace s progresí onemocnění IM do dysplazie nebo GC nebo perzistence IM. Bylo zjištěno, že významný podíl sCNA ve vzorcích IM se nachází na chromozomu 8q, kde sídlí onkogen Myc. Bude vyvinut přizpůsobený molekulární test založený na panelu primárně zacíleném na genomové oblasti s rekurentně mutovanými geny a amplifikaci chromozomu 8q u pacientů s IM. Přizpůsobený test má za cíl dále stratifikovat pacienty s IM. Celková genomická DNA bude extrahována z biopsií (zmrazené tkáně a FFPE) a odpovídajících vzorků krve. Cílený genový panel bude aplikován tak, aby byly zachyceny specifické genomové oblasti zájmu, což výrazně sníží náklady a množství analýzy dat. Příprava knihovny bude provedena pomocí testů cílového obohacení podle pokynů výrobce. Volání mutací a amplifikace chromozomu 8q budou určeny pomocí softwaru Genome Analysis Toolkit (GATK). Subjekty jsou klasifikovány jako pozitivní v testu, pokud je identifikována somatická varianta s alespoň 10 variantami podporujícími čtení nebo varianta počtu kopií se segmentovaným středním pokrytím alespoň 2 standardní odchylky od kopírově neutrálního průměru.

Profilování miRNA: Celková RNA ze séra se izoluje a převede na cDNA, která se poté kvantifikuje. Cílové úrovně exprese miRNA po normalizaci technických i biologických variací jsou analyzovány, aby se identifikovaly panely miRNA s nejvyšší rozlišovací schopností mezi zdravými a chorobnými stavy. Každému subjektu bude přiděleno skóre na základě profilu exprese miRNA, což naznačuje možnost mít GC. Výsledek bude porovnán s OGD a histologií, která je zlatým standardem pro diagnostiku GC.

Následovat:

Subjekty budou sledovány na klinice nebo telefonicky pro aktualizaci stavu v 1. a 3. roce. Klinická data budou sbírána prostřednictvím dotazníku. Období okna 6 měsíců před nebo po výročním základním datu OGD je přijatelné.

Subjekty podstoupí pozorovací OGD v letech 2 a 4, aby se posoudilo, zda subjekt dosáhl koncového bodu. Biopsie budou odebrány podle popsaného protokolu. Klinická data budou shromažďována prostřednictvím dotazníku a databáze aktualizována. Období okna 6 měsíců před nebo po výročním základním datu OGD je přijatelné.

Subjekty budou každoročně sledovány na klinice nebo telefonicky pro aktualizaci stavu pro roky 5-10. Klinická data budou sbírána prostřednictvím dotazníku. Období okna 6 měsíců před nebo po výročním základním datu OGD je přijatelné. Pokud by výskyt GC ve 4. roce nebo po něm u kohorty postačoval k zamítnutí nulové hypotézy s hladinou významnosti a síly, jak je popsáno, může být roční sledování v letech 5-10 přerušeno.

Vzorový výpočet velikosti:

Navrhovaná velikost vzorku pro prospektivní kohortovou studii byla odhadnuta pomocí logrank testu pro výsledek doby do progrese. Za předpokladu 4leté kumulativní incidence progrese 10 % ve skupině s pozitivním testem a 3 % ve skupině s negativním testem (tj. hazard ratio, HR = 3,5), bude vyžadována velikost vzorku 480 na základě hladiny významnosti 5 % a mocniny 85 %. Dále za předpokladu 5% opotřebení bude celková velikost vzorku 500.

Statistická analýza:

Kategorické proměnné budou analyzovány pomocí chí-kvadrát testu nebo Fisherova exaktního testu. Spojité proměnné budou analyzovány pomocí Studentova t-testu nebo Mann-Whitneyho U testu. Parametry s hodnotou P <0,05 v jednorozměrné analýze budou zahrnuty do vícerozměrné analýzy. Multivariační analýza bude provedena pomocí Coxovy regresní analýzy. P <0,05 je považováno za statisticky významné.