Nový integrativní neinvazivní přístup k výběru embryí pro oplodnění in vitro založený na morfokinetické analýze s vylepšenou umělou inteligencí a Ramanových spektrech ve spotřebovaných kultivačních médiích

Naše studie bude zahrnovat dvě fáze. Ve fázi I (retrospektivní studie) budou shromažďována archivovaná data pro trénování metody CNN-enhanced MK s RS na selekci embryí, což povede k integrovanému přístupu (MK-RS). Ve fázi II (prospektivní studie) bude zavedená integrovaná metoda MK-RS použita k výběru embryí, hodnocení klinické míry těhotenství a hodnocení účinnosti našeho přístupu v randomizované kontrolované studii.

Ve fázi I budou snímky embrya pořizovány každých 10 minut vestavěným mikroskopem a kamerou v časosběrném inkubátoru. Snímky budou poté vyhodnoceny pomocí algoritmu CNN pro segmentaci lidského embrya první den, aby se identifikovaly tři odlišné rysy: zona pellucida (ZP), cytoplazma a pronukleus (PN). Morfodynamika těchto tří znaků během oplození do prvního dělení bude zabalena jako data časových řad pro integraci. Změny morfologie po prvním dělení budou poloautomaticky anotovány, které budou analyzovány komerčním skórovacím systémem MK (KID Score).

Po odstranění embryí/blastocyst z kultivační misky bude odpovídající vyčerpané kultivační médium (SCM) odebráno do sterilních zkumavek pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Prázdná kultivační média budou také odebrána se stejným operačním standardem. Speciálně navržený vzorkovač bude použit k napipetování 7 μl SCM každého vzorku, který projde olejovou vrstvou SCM, a poté jej nakape na jednorázové podložní sklíčko z křemenného skla a osvětlí systémem RS (Basecare Raman 200, Čína). Systém RS bude před testováním kalibrován na 520,5 cm-1 křemíkovým plátkem. Parametry excitace laseru jsou nastaveny následovně: vlnová délka 785 nm, výkon 320 mW a průměr laserové skvrny 100 μm. Signály jsou zachycovány ve standardním režimu pomocí kamery CCD (chargecoupled device) s integrační dobou 20 sekund. Pro každý alikvot se provedou tři replikáty. Rekalibrace je nezbytná, když se testují různá kultivační média, vzhledem k tomu, že médium G-1 se používá pro embrya před 3. dnem a médium G-2 se používá pro embrya po 3. dni. Všechna získaná spektra budou předzpracována odečtením signálu pozadí. Spektroskopické signály v blízké infračervené oblasti (600 cm-1-1800 cm-1) jsou analyzovány pro vektorovou normalizaci pomocí softwaru Labspec 6 (Horiba, Japonsko). Naše předchozí vzorky SCM se známými výsledky ploidie TE budou použity jako trénovací datový soubor pro stanovení standardů klasifikace euploid-aneuploid. Algoritmus klasifikace stohování bude přijat s ohledem na jeho vysokou celkovou přesnost (95,9 %, nepublikovaná data).

Protože segmentovaná časová řada algoritmu CNN, anotace KID Score a výsledky profilování RS mají stovky podparametrů, sestavíme je společně se souborovým učením, které považuje každý podparametr za slabý klasifikátor a během tréninku přerozdělí jejich váhy. Primárním indexem pro trénink je výsledek klinického těhotenství a pro ultimaci informací pod MK a RS se zesíleným CNN budou jako sekundární index použity výsledky tvorby blastocyst. Poměr tréninkové a testovací sady bude 1:1 a v tréninkové sadě bude provedena 5-ti násobná křížová validace pro sledování přesazení.

Fáze II bude zahrnovat prospektivní, jednoduše zaslepenou, randomizovanou kontrolovanou studii navrženou k ověření trénované metody MK-RS pro selekci embryí. Metabolomické profilování SCM pomocí RS s CNN-enhanced analýzou MK bude použito k posouzení vývojového potenciálu embrya spolu s tradičním morfologickým hodnocením embryí. Výsledky vývojového potenciálu embryí budou použity k výběru nejlepší kvality embryí. Senzitivita a specificita bude hodnocena pomocí pacientovy biopsie TE nebo výsledků neinvazivního prenatálního testování (NIPT), které dále potvrdí skórování metody MK-RS, pokud je k dispozici.

Randomizace:

Ve fázi II budou účastníci, kteří splňují všechna zařazovací a vylučovací kritéria a souhlasí s připojením ke studii, randomizováni do experimentální skupiny a kontrolní skupiny v poměru 1:1 pomocí počítačem generovaného randomizačního seznamu. Pro experimentální skupinu bude selekce embryí založena na metodě MK-RS zavedené ve fázi I, zatímco selekce embryí pro kontrolní skupinu bude spoléhat pouze na výsledky tradičního morfologického hodnocení embryí. Všichni účastníci budou v tomto testu oslepeni.