Biomarkery v diagnostice a prognóze NAFLD

Popis projektu:

V moderní společnosti s příchodem průmyslového rozvoje došlo k velké úpravě životního stylu, což vedlo k nezdravým návykům, jako je přejídání a konzumace rychlého občerstvení (po nevyvážené stravě bohaté na cukry a tuky) a snížení fyzické aktivity. V Evropské unii trpí nadváhou nebo obezitou více než polovina dospělých. Tato skupina jedinců je považována za vysoce rizikovou pro rozvoj chronických jaterních onemocnění, jako je nealkoholické ztučnění jater (NAFLD). Mnoho epidemiologických zpráv spojuje nástup NAFLD se špatným výběrem stravy a sedavými návyky. V současné době neexistují žádné účinné farmakologické terapie a jediným způsobem, jak tomuto stavu předejít nebo jej zlepšit, je vést zdravější životní styl (personalizované diety, fyzická aktivita a kognitivně-behaviorální psychologické terapie). Hlavním omezením tohoto řešení je nedostatečná adaptabilita pacienta na terapii.

NAFLD zahrnuje široké histologické spektrum od jednoduché steatózy po nealkoholickou steatohepatitidu (NASH). NASH je charakterizována steatózou se zánětem a může představovat různá stadia fibrózy, od nepřítomnosti až po cirhózu. Zlatým standardem pro diagnostiku a hodnocení stadia fibrózy zůstává jaterní biopsie. Provedení jaterní biopsie u každého pacienta s podezřením na NAFLD je však nemožné, a to jak z etických důvodů, tak i proto, že se nejedná o validní screeningovou metodu. Proto je nutné vyvinout neinvazivní metody screeningu a diagnostiky. Včasná diagnóza by navíc mohla zvýšit povědomí pacientů o jejich chronickém onemocnění a motivovat je ke změně životního stylu.

Vzhledem k tomu je proto nutné vyvinout neinvazivní metody screeningu a diagnostiky. Včasná diagnóza by navíc mohla zvýšit povědomí pacienta o svém chronickém stavu a přesvědčit ho, aby změnil svůj životní styl.

Je třeba vzít v úvahu, že identifikace nových markerů může být velmi náročný úkol kvůli:

Složitost fyziopatologie. Na progresi onemocnění se podílí více faktorů. Přítomnost společných mediátorů u mnoha dalších fibrotických poruch. Zásadní význam má proto originální strategie zaměřená na objevování nových biomarkerů. Díky rozvoji vysoce výkonných technologií je v dnešní době v online databázích snadno dostupné obrovské množství genomických a proteomických dat. Je tedy možné studovat interaktom (protein-proteinové interakce -PPI- v buňce) pomocí softwaru s otevřeným zdrojovým kódem, jako je Cytoscape. Tímto způsobem nám využití bioinformatiky umožňuje analyzovat data biologické sítě in silico, což představuje způsob, jak identifikovat biomarkery klinického zájmu bez potřeby drahého vybavení.

Objektivní:

Cílem tohoto projektu je identifikovat (prostřednictvím in silico analýzy) a validovat nové biomarkery, které jsou užitečné pro diagnostiku a prognózu NAFLD, které lze použít v neinvazivních klinických testech.

Naším původním přístupem při identifikaci kandidátských biomarkerů bylo použití následujících pracovních kritérií ve studiích in silico:

1. Získejte data PPI z databází, které dodržují pokyny konsorcia International Molecular Exchange (IMEx).
2. Vytvořte biologické sítě pro proteiny uvedené v tabulce 1 (které byly v nedávných vědeckých časopisech navrženy jako kandidáti pro diagnózu NAFLD).
3. Vytvořte biologické sítě pro proteiny uvolňované hepatickými hvězdicovými buňkami (HSC), které indikují aktivaci/reverzi myofibroblastického fenotypu (HSC jsou hlavní buňky zapojené do jaterní fibrózy). Viz tabulka 1.
4. Zahrňte do našich studií známý marker aktivace HSC (α-aktin hladkého svalstva, α-SMA) a základní složku extracelulární matrix (ECM): kolagen alfa-III typu I (Col3A1).
5. Vyberte požadované proteiny, tedy takové, které se uvolňují v séru a které spojují největší počet biologických sítí.

Tabulka 1 - Kandidátské biomarkery popsané v literatuře Protein Relevantní informace Lokalizace Cytokeratin-18 (CK-18) Indikátor hepatocelulární apoptózy. Navrženo jako biomarker v cytoplazmě NAFLD, jádro adipocytový protein vázající mastné kyseliny (AFABP) Uváděno jako biomarker v NAFLD Cytoplasma Fibroblastový růstový faktor 21 (FGF21) Zvýšená exprese v játrech a séru, koreluje se stupněm steatózy Uvolněný růst podobný inzulínu protein vázající faktor 3 (IGFBP-3) Navrhován jako biomarker pro NAFLD v nedávné studii sérového proteomu Sekretovaný lymfocytární cytosolický protein 1 (LCP1) Aktin vázající protein, navržený jako biomarker v NAFLD Cytoplasma, membránový galektin-1 (LGALS1) Zvýšená exprese v aktivovaných HSC Secernovaný ubikvitinový konjugační faktor E4B (UBE4B) Zvýšená exprese v aktivovaných HSC Cytoplazma, secernovaný vitronektin (VTN) Zvýšená exprese v inaktivovaných HSC Secernovaný osteopontin (OPN) Složka ECM Secernovaná lamininová podjednotka beta 1 (LAMB1) Snížená exprese v inaktivované HSC Secernované α-SMA Zvýšená exprese v aktivovaných HSC Cytoplazma Col3A1 Zvýšená produkce ve fibrogenezi (složka extracelulární matrix) Secernovaná

Na základě popsaných pracovních kritérií a pomocí Cytoscape jsme získali integrovanou biologickou síť (obrázek 1), kde každá ze sítí PPI vytvořených pro proteiny v tabulce 1 (12 biologických sítí) byla propojena prostřednictvím společných interakčních proteinů (společní partneři). Tyto běžné proteiny, zejména ty, které uvolňují buňky (rozpustné faktory), budou našimi cílovými proteiny.

Z naší předběžné analýzy jsme identifikovali následující proteiny jako potenciální biomarkery: IGF-2 (inzulínu podobný růstový faktor 2), SPARC (sekretovaný protein kyselý a bohatý na cystein), EPICAN a EGFR (receptor epidermálního růstového faktoru) (zvýrazněno červeně na obrázku 1).

Experimentální plán

Výzkumné aktivity budou prováděny v Italian Liver Foundation. Odběr vzorků bude probíhat na Všeobecném chirurgickém oddělení nemocnice Cattinara.

K dosažení popsaných cílů budou zapojeny skupiny pacientů kandidátů na bariatrickou chirurgii na oddělení všeobecné chirurgie. Je naplánována lékařská návštěva, během níž budou shromážděny obecné klinické informace a změřena váha, výška, obvod pasu a krevní tlak. V rámci rutinní předoperační přípravy a ambulantního sledování jsou sledovány obecné hematologické a biochemické parametry (kompletní krevní obraz, glukóza, inzulín, triglyceridy, celkový cholesterol, HDL, transferin, feritin, sérové ​​železo, C-reaktivní protein), játra funkce (transaminázy, albumin, celkový protein) a funkce ledvin (kreatinin, močový kreatinin, mikroalbuminurie) budou hodnoceny běžnými laboratorními testy na vzorcích plazmy/séra. Další alikvot odebraných vzorků bude použit pro extrakci RNA a proteinů a následné posouzení kvality vzorku. Odběr krve, který se rutinně provádí pro diagnostická vyšetření a předoperační posouzení, může zahrnovat momentální bolest v místě vpichu a výskyt modřiny (hematomu), což jsou komplikace, které mohou nastat při jakémkoli odběru krve.

Dále bude před operací provedena jaterní elastometrie, která nám umožní porovnat radiologické výsledky s výsledky laboratorními. Jedná se o neinvazivní vyšetření podobné ultrazvuku. Tato vyšetření se budou opakovat po jednom roce po operaci, aby se kvantifikovala očekávaná zlepšení, zatímco po šesti měsících se bude opakovat pouze odběr krve. Oba zákroky zastřeší Všeobecné chirurgické oddělení.

Během bariatrické operace, která je plánována pro obezitu podle národních doporučení SICOB, budou provedeny biopsie podkožního, jaterního a viscerálního tuku. Tyto biopsie významně neprodlužují operační časy. U těchto tří vzorků bude ověřena přítomnost a množství studovaných markerů. Část jaterní biopsie bude navíc odeslána na patologické oddělení k definitivnímu histologickému vyšetření ke studiu stupně fibrózy a steatózy. Odebrané a uchované vzorky pro tento výzkum budou použity ke sledování zdravotního stavu pacienta. Výsledky této studie by navíc mohly být užitečné pro další pacienty tím, že přispějí ke zlepšení léčby a prevence nealkoholického ztučnění jater.

Pacientovi plánovanému na operaci bude před výkonem vydán a vysvětlen formulář informovaného souhlasu, kde jsou popsány výše uvedené postupy, rizika a přínosy.

Experimentální plán lze rozdělit do tří fází:

Fáze 1: Hloubkové studie in silico. Předpokládaná doba: 1 měsíc.

Fáze 2: Studie in vivo, odběr vzorků (krev a jater), banka vzorků. Sběr klinických a laboratorních dat pro každého pacienta.

Extrakce RNA a proteinů s následným hodnocením kvality vzorku. Kvantifikace exprese mRNA pro panel biomarkerů (tabulka 1 + potenciální biomarkery).

Sérum a tkáň (játra) kvantifikace kandidátních biomarkerů pomocí ELISA/Western blot.

Předpokládaná doba: 9 měsíců.

Fáze 3: Ověření výsledků:

Získané výsledky budou korelovány s klinicko-analytickými daty (krevní hodnoty), biopsií jater (histopatologická data) a dostupnými zobrazovacími technikami (ultrazvuk, elastografie) v nemocnici Cattinara. Provede se statistická analýza pro korelaci nových biomarkerů se stádiem onemocnění.

Předpokládaná doba: 2 měsíce.

Obrázek 1: In silico studie.

Velikost vzorku a statistická analýza:

Do studie je plánováno zařazení celkem 62 pacientů jak hospitalizovaných, tak ambulantních. Základní rovnice pro výpočet velikosti vzorku je následující:

N = (2 x (Za + Zp)2 x S2) / d2

N = požadované subjekty v každé výběrové skupině. Vytvořili jsme dvě skupiny: skupinu A (bez nebo s mírnou fibrózou, Brunt: 0-1) a skupinu B (středně těžká až těžká fibróza, Brunt: 2-3).

Zα = Z-hodnota pro požadované riziko (pro nás je to 1,96 pro bilaterální test). Zβ = Z-hodnota pro požadované riziko (pro nás je to 1,282 pro bilaterální test). S2 = rozptyl nebo rozptyl kvantitativního parametru pro kontrolní nebo referenční skupinu (pro nás referenční skupina: skupina A, hodnota rozptylu = 150 U/L).

d = Minimální hodnota detekovatelného rozdílu (pro nás 200 U/L).

Vypočtená velikost vzorku pro každou skupinu pomocí tohoto postupu je 29,3. Přidání korekce na možnost ztráty vzorku při 5 % dává celkem 30,87. Celkový počet vzorků je 62. Tuto analýzu jsme použili na jeden z markerů ve studii (CK-18), protože je v literatuře nejčastěji uváděn. Vzhledem k tomu, že naše studie zahrnuje studii 4 biomarkerů, je možné, že práce s panelem markerů zvýší pravděpodobnost výsledků studie (potenciálně sníží požadovaný počet vzorků).

Užitečnost studie:

V oblasti chronických onemocnění jater, jako je NAFLD, existuje naléhavá potřeba identifikace a vývoje neinvazivních technik pro diagnostiku a klinickou prognózu. Tyto metody povedou k rychlejšímu klinickému rozhodování, z čehož budou mít prospěch jak pacienti, tak zdravotnický personál. Proto si výsledky získané z této studie kladou za cíl přispět k identifikaci a validaci nových sérových biomarkerů ke zlepšení diagnostiky, screeningu a léčby NAFLD. Kromě toho se předpokládá, že ověřené biomarkery mohou být také použity jako prognostické markery u jiných onemocnění jater, která progredují se zánětem a fibrózou. Dostupnost neinvazivních biomarkerů by měla okamžitý dopad na klinickou praxi, rozlišující mezi jednotlivci s vysokou mírou progrese fibrózy a těmi, kteří mohou zůstat v neproliferativní fázi nebo dokonce dosáhnout remise. Tyto informace by přispěly k přesnějšímu výběru a účinnosti terapie, čímž by se zlepšil celkový výsledek pacienta. Navíc identifikace specifických biomarkerů spolu s přítomností banky biologických vzorků v naší instituci poskytuje potenciál důkladně studovat molekulární procesy, které se podílejí nejen na tomto stavu, ale i na jiných fibrogenních procesech v játrech, s možností identifikace nových farmakologických cílů.

Vzhledem k observační povaze navrhované studie nejsou vyžadována žádná další pojištění kromě těch, která jsou již poskytnuta pro běžnou klinickou praxi.