Klíčové mechanismy abnormální aktivace a diferenciace T buněk u očního onemocnění souvisejícího s IgG4

Onemocnění související s imunoglobulinem-G4 (IgG4-RD) je nově definované imunitou zprostředkované chronické zánětlivé onemocnění s fibrózou, charakterizované lymfoplasmacytickou infiltrací převážně tvořenou IgG4+ plazmatickými buňkami, spolu se storiformní fibrózou, obliterativní flebitidou a eozinofilní infiltrací. Mezi nejčastější klinické projevy IgG4-RD patří významně zvýšené hladiny IgG4 v séru a léze podobné hmotě, které mohou postihnout téměř jakoukoli část těla, což vede ke kompresi a nevratnému poškození postižených orgánů a okolních tkání, což může mít za následek selhání orgánů. Navzdory zprávám, které odhadují prevalenci IgG4-RD mezi (0,28~1,08)/100 000, může být skutečná prevalence vyšší kvůli její nedávné definici, omezenému povědomí mezi klinickými lékaři a pacienty a jejímu záludnému začátku.

Oční onemocnění související s imunoglobulinem-G4 (IgG4-ROD) označuje IgG4-RD hmotu podobné léze zahrnující slznou žlázu, extraokulární svaly, supraorbitální nerv, infraorbitální nerv a další orbitální struktury, které vedou k orbitálním lézím. Mezi nimi je nejčastější postižení slzných žláz, které se projevuje nebolestivým, jednostranným nebo oboustranným otokem, někdy doprovázeným pocitem cizího tělesa nebo nepříjemným pocitem v očích. Postižení extraokulárních svalů se může projevit jako zvětšení svalů, které může v těžkých případech způsobit proptózu, rozmazané vidění a diplopii. Orbitální masové léze mohou také komprimovat optický nerv, což vede k nevratné ztrátě zraku. Zatímco v současné době neexistuje žádný lék na IgG4-ROD, glukokortikoidy se používají jako léčba první volby ke kontrole zánětu a fibrózy spojené s lézemi podobnými hmotě. IgG4-ROD je náchylný k relapsu, a přestože neexistují žádné studie specificky týkající se jeho míry recidivy, různé studie uvádějí míru relapsu u pacientů s IgG4-RD během sledování v rozmezí od 24 % do 63 %. Přesná etiologie a patogeneze IgG4-ROD zůstává nejasná a další objasnění těchto aspektů by usnadnilo identifikaci nových terapeutických cílů, snížilo míru relapsů a potenciálně by dosáhlo vyléčení.

Mnohočetné studie na různých formách IgG4-RD naznačují kritickou roli T buněk v patogenezi IgG4-RD, včetně IgG4-ROD. Za prvé, CD4+ T buňky tvoří většinu infiltrujících lymfocytů v lézích IgG4-RD. Tyto CD4+ T buňky indukují proliferaci B buněk a změnu třídy prostřednictvím sekrece cytokinů a přispívají k tkáňové fibróze. Kromě toho pacienti s IgG4-RD léčení rituximabem vykazují vysokou míru relapsů, přičemž klony B buněk po relapsu expandují odlišně ve srovnání s předléčbou. Tento důkaz silně podporuje ústřední roli T buněk v IgG4-RD. Mezi subpopulacemi T buněk zapojených do patogeneze IgG4-RD jsou zvláště pozoruhodné T folikulární pomocné buňky (Tfh) a CD4+ cytotoxické T lymfocyty (CD4+ CTL). Buňky Tfh podporují tvorbu ektopického zárodečného centra a změnu třídy B buněk na plazmatické buňky IgG4+ prostřednictvím sekrece IL-21, zatímco CD4+ CTL přispívají k tkáňové fibróze sekrecí TGF-p, IL-1p a IFN-y. Mechanismy, které jsou základem abnormální aktivace a diferenciace T buněk jak u IgG4-ROD, tak u jiných IgG4-RD, však zůstávají špatně pochopeny.

Tato studie si klade za cíl prozkoumat klíčové dráhy zapojené do abnormální aktivace a diferenciace T buněk v IgG4-ROD provedením série in vitro experimentů s použitím chirurgických vzorků tkáně, periferní krve a slzné tekutiny od pacientů s IgG4-ROD. Tyto experimenty zahrnují sekvenování RNA (RNA-Seq), enzymatické imunosorbentní testy (ELISA) a in vitro buněčnou kokultivaci. Cílem je identifikovat kritické dráhy v patogenezi IgG4-ROD a objasnit jejich roli v procesu onemocnění, poskytnout nové terapeutické cíle pro snížení míry recidivy IgG4-ROD. Tento výzkum může také nabídnout pohled na mechanismy a léčbu jiných onemocnění souvisejících s IgG4.

Studijní populace

Tato studie zahrnuje pacienty z Oftalmologické kliniky 3. nemocnice Pekingské univerzity, včetně vzorků tkáně slzných žláz od pacientů s IgG4-ROD (experimentální skupina) a pacientů s ptózou slzných žláz podstupujících chirurgickou repozici (kontrolní skupina). Kritéria pro zařazení a vyloučení jsou následující:

Kritéria začlenění

Experimentální skupina: Pacienti s IgG4-ROD s postižením slzných žláz, diagnostikovaní na základě japonských kritérií z let 2014 a 2020 pro IgG4-ROD a IgG4-RD:

Klinické a zobrazovací znaky: charakteristický difúzní nebo lokalizovaný otok nebo nodulární útvary slzných žláz.

Sérologická diagnóza: Zvýšená koncentrace IgG4 v séru (>135 mg/dl).

Histopatologická diagnóza (splňující 2 ze 3 níže uvedených kritérií):

Hustá lymfoplasmacytická infiltrace s fibrózou. Poměr IgG4+ plazmatických buněk/IgG+ plazmatických buněk >40 % a >10 IgG4+ plazmatických buněk na vysoce výkonné pole.

Charakteristická fibróza, zejména storiformní fibróza nebo obliterativní flebitida.

Kontrolní skupina: Pacienti s ptózou slzných žláz potvrzenou patologií a klinickými/zobrazovacími znaky, vyžadující chirurgickou repozici.

Kritéria vyloučení

Přítomnost dalších autoimunitních onemocnění, jako je Sjögrenův syndrom, systémový lupus erythematodes nebo revmatoidní artritida.

Patologie slzné žlázy indikující jiná orbitální onemocnění, jako je MALT lymfom nebo zánětlivý pseudotumor.

Mezi další vylučovací kritéria patří duševní poruchy, malignity nebo jakýkoli stav, který je považován za nevhodný pro účast ve studii.

Studijní metody

Shromažďování klinických informací Zaznamenává se demografie pacienta, anamnéza a nezbytné výsledky diagnostických testů (např. zobrazení, hladiny IgG v séru). Mezi oční vyšetření patří mimo jiné zraková ostrost, nitrooční tlak, index Ocular Surface Disease Index (OSDI), barvení rohovky fluoresceinem (CFS), doba rozpadu slzného filmu (FBUT) a Schirmerův test.

Odběr vzorků Slzná tekutina (asi 15 ul na oko) se odebírá pomocí kapilární zkumavky a skladuje se při -80 °C. Část (50-100 mg) resekované tkáně slzné žlázy je vyhrazena pro tuto studii, zatímco zbytek je použit pro patologickou analýzu. Odeberou se vzorky krve (přibližně 10 ml) pro přípravu mononukleárních buněk periferní krve (PBMC).

Hromadná analýza RNA-Seq tkáně slzné žlázy Celková RNA je extrahována z tkáně slzné žlázy pomocí metody Trizol, po které následuje hodnocení kvality RNA pomocí bioanalyzátoru Agilent. Knihovna cDNA je konstruována a sekvenována pomocí technologie Illumina. Zpracování dat zahrnuje kontrolu kvality pomocí fastp, zarovnání pomocí HISAT2 a kvantifikaci genové exprese pomocí featureCounts. Analýza diferenciální exprese se provádí pomocí DESeq2 a provádí se analýza obohacování genové sady (GSEA). Složení imunitních buněk ve tkáni se analyzuje pomocí xCell a CIBERSORTx.

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ELISA se používá k analýze klíčových cest identifikovaných ve výsledcích RNA-Seq za použití specifických souprav podle pokynů výrobce.

Experimenty s kokultivací in vitro Systém kokultivace in vitro buněk slzné žlázy pacienta IgG4-ROD a PBMC je vytvořen pro simulaci imunitního mikroprostředí slzné žlázy. Na základě výsledků RNA-Seq a ELISA jsou na tento systém aplikovány cílené intervence. Poměry IgG4/IgG1 v supernatantu slouží jako indikátor, přičemž vyšší hodnoty naznačují silnější patogenní účinky.