Molekulární biologie análního karcinomu u HIV pozitivních pacientů

Pozadí:

V éře vysoce aktivní antiretrovirové terapie (HAART) zůstává výskyt mnoha rakovin u HIV pozitivních vyšší než v běžné populaci. To platí nejen pro malignity definující AIDS, jako je Kaposiho sarkom nebo lymfom, ale také pro jiné druhy rakoviny, které tvoří 58 % všech novotvarů v nedávno popsané kohortě v USA [1]. Tento trend vyvolal obnovený zájem o pochopení molekulárních mechanismů karcinogeneze u pacientů s potlačenou imunitou. Možná vysvětlení zahrnují prodloužené přežití pacientů s HIV na HAART, vysoký výskyt koinfekce onkogenními viry a vystavení rizikům, jako je kouření a alkohol [2].

Spinocelulární karcinom anu (SCCA) vyžaduje integraci DNA lidského papilomaviru (HPV) do chromozomů buněk análního kanálu. HIV pozitivní muži jsou vystaveni zvýšenému riziku vzniku rakoviny konečníku. Švýcarská studie spojující švýcarskou kohortovou studii HIV a švýcarské kantonální registry rakoviny prokázala výrazně zvýšené SIR pro rakovinu konečníku (SIR = 33,4, 95% CI = 10,5-78,6) [3]. Je zřejmé, že koinfekce HPV-HIV hraje hlavní roli ve vývoji SCCA, ale zda je tento příspěvek spojen s odlišnou molekulární cestou karcinogeneze, zůstává hypotetické [4].

Anální karcinom se vyskytuje dříve u HIV pozitivních jedinců (průměrný věk 37 let) ve srovnání s HIV negativními muži (58 let) a HIV negativními ženami (65 let). Tento rozdíl dvou desetiletí ve věku nástupu podporuje hypotézu, že biologie SCCA se u HIV pozitivních a HIV negativních pacientů liší [5]. Účinek infekce HIV na přirozenou historii anální infekce HPV je špatně pochopen, ale většina odborníků se shoduje na dvou bodech: 1) 95 % HIV pozitivních homosexuálních mužů je koinfikováno HPV; a 2) HIV infekce podporuje perzistenci HPV infekce v ano-genitálním traktu (děložní čípek, vagína a anální kanál).

Na progresi rakoviny se podílejí dva hlavní a vzájemně se vylučující typy genomové nestability. První, známá jako chromozomální nestabilita (CIN), je výsledkem řady genetických změn, včetně aktivace onkogenů a inaktivace tumor-supresorových genů, jako jsou p53 a APC. Druhá, známá jako mikrosatelitová nestabilita (MSI), je důsledkem somatické (získané) inaktivace genů pro opravu chybného párování DNA (MMR), jako je MLH1 (hypermethylací jeho promotoru), což typicky vede k mutaci genů s kódujícími mikrosatelity, jako je např. BAT 25, BAT26 a CAT25, receptor transformujícího růstového faktoru II (TGF-RII) a BAX [6].

MSI odráží nestabilitu celého genomu (vyplývající z deficitního systému MMR) a vyskytuje se se zvýšenou frekvencí u cervikální intraepiteliální a plicní neoplazie související s HIV. V obou případech byla frekvence MSI šestkrát vyšší u nádorů asociovaných s HIV ve srovnání s nádory u HIV-indeterminovaných pacientů [7]. Jiní autoři také zaznamenali vysokou míru MSI u Kaposiho sarkomů a agresivních lymfomů získaných od pacientů infikovaných HIV, zatímco u lézí HIV negativních pacientů neexistují žádné důkazy o podobné nestabilitě [8]. Nedávné pozorování, že fenotyp MSI je omezen na lymfomy související s HIV, naznačuje, že zásadní rys rakoviny, jako je genetická nestabilita, může být vysoce ovlivněn imunitou hostitele [9].

MSI status SCCA u HIV pozitivních pacientů nebyl nikdy zkoumán, ale provedli jsme CIN analýzu vzorků nádorů od 18 HIV- a 10 HIV+ pacientů s diagnózou SCCA ve dvou institucích v USA [10]. Nádory u HIV-negativních pacientů vykazovaly vyšší pravděpodobnost CIN než nádory u HIV-pozitivních pacientů (24,1 % versus 6,6 %, P<0,001). U HIV-negativních pacientů se SCCA byla pozorována konzistentní ztráta heterozygotnosti (LOH) na chromozomech 17p, 18q, 5q a 11q. Naproti tomu alelická ztráta na 17p, 5q a 18q prakticky chyběla u nádorů HIV-pozitivních jedinců, což ukazuje, že imunitní suprese podporuje progresi SCCA prostřednictvím alternativní cesty k CIN.

Vlastní výzkum v terénu:

Žadatel je kolorektální chirurg, který se od roku 2001 přímo podílí na léčbě pacientů s anorektálními malignitami. Shromáždil předběžná data ukazující specifické vzorce molekulárních aberací u SCCA souvisejících s HIV. Tato zjištění byla publikována v recenzovaných časopisech, což má za následek, že žadatel je pravidelně žádán redaktory, aby napsal odborné posudky a nejnovější recenze v oboru.

Švýcarská kohorta HIV pozitivních pacientů poskytne jedinečnou příležitost k provedení tohoto výzkumu kvůli velkému počtu jedinců, kteří jsou již zapsáni do stávající databáze, a existujícím odborným znalostem v oboru, které vyvinul profesor Hirschel a jeho tým. Velká populace pacientů je skutečně nezbytnou podmínkou pro zahájení tohoto projektu kvůli relativní vzácnosti těchto nádorů.

V neposlední řadě bude molekulární aspekt tohoto výzkumu probíhat v laboratoři Dr. Pierra Huttera, PhD, který je u nás lídrem v detekci hereditárního nepolypózního kolorektálního karcinomu (HNPCC). Laboratoř Dr. Huttera tedy poskytne vynikající prostředí pro provádění zde popsaných molekulárních analýz.

Studujte hypotézy:

Předpokládáme, že v populaci HIV je mikrosatelitní nestabilita spíše než chromozomální nestabilita upřednostňovanou cestou pro rychlou progresi anální intraepiteliální neoplazie směrem k invazivní SCCA. Druhá hypotéza je, že pro srovnání MSI buď chybí, nebo je alespoň velmi vzácná u SCCA HIV-negativních jedinců.

Studijní cíle a cíle

Primárním cílem této studie je posoudit stav nestability mikrosatelitů ve vzorcích nádoru 15 HIV pozitivních pacientů ze švýcarské kohorty, u kterých byla diagnostikována SCCA; poté bude provedena předběžná analýza ke stanovení incidence MSI u SCCA u HIV pozitivních pacientů. Pokud většina nádorů vykazuje MSI v této populaci, přistoupíme k druhé části studie, jejímž cílem je provést stejné analýzy u podobných nádorů u 15 HIV negativních pacientů a porovnat tak molekulární profily SCCA v obě populace. Tímto způsobem by mohla být stanovena potenciální role imunitní suprese v progresi karcinogeneze.

Návrh a plán studie

Pacienti:

Pomocí stávající databáze budou identifikováni pacienti ze švýcarské HIV kohorty s biopsií ověřenou diagnózou spinocelulárního karcinomu řitního otvoru. Vybíráme analýzu alespoň 15 vzorků, v závislosti na dostupnosti, mezi 3 SHCS středisky. Nádory od HIV-negativních pacientů, kteří podstoupili operaci SCCA, budou získány z Ústavu patologie Fakultní nemocnice v Ženevě, dokud nebude protokol přezkoumán místní etickou komisí.

Zásah:

Všechny vzorky nádorů budou znovu posouzeny pro potvrzení diagnózy patologem. Pro každého pacienta budou vybrány parafinové bloky s nádorovou tkání a normální sliznicí pro extrakci DNA a polymerázovou řetězovou reakci na mikrosatelitních cílech. Tkáně byly rutinně odebrány z operačního sálu, fixovány v pufrovaném formalínu, zalité v parafínu a skladovány po různý počet měsíců před selekcí pro analýzu. Bloky zalité v parafínu se nařežou mikrotomem na řezy o tloušťce 20 µm. Pomocí sterilní čepele skalpelu budou pod pitevním mikroskopem mikrodisekovány oblasti normální (nenádorové) a rakovinné tkáně, přičemž jako vodítko se použije řez obarvený hematoxylinem a eosinem. Vzorky budou zbaveny parafinu v toluolu, purifikovány absolutním ethanolem a centrifugovány při 14 000 ot./min. Předchozí zkušenosti v laboratoři Dr. Huttera ukázaly, že je skutečně technicky možné provést tento typ molekulární analýzy ve vzorku nádoru zalitého v parafínu.

Ke stanovení přítomnosti mikrosatelitové nestability u SCCA použijeme referenční panel mikrosatelitních primerů doporučených pro vzorky kolorektálního karcinomu. Patří mezi ně mikrosatelitní markery BAT25, BAT26 a také CAT25.

Hodnocení studie:

Počáteční vyhodnocení dat bude provedeno po analýze prvních 15 vzorků nádorů. Pokud je MSI detekován v HIV pozitivní populaci, bude provedeno další vyšetřování u nádorů HIV negativních pacientů. Analýza dat bude v pravidelných intervalech podléhat zprávám o pokroku prováděným se všemi vyšetřovateli. Rozhodli jsme se omezit, alespoň zpočátku, naši analýzu na 15 nádorů ze tří důvodů:

1. Jedná se o relativně vzácnou rakovinu a je nepravděpodobné, že se nám podaří získat více než 25 pacientů se SCCA ze švýcarské kohorty HIV.
2. Naše předchozí studie byla provedena s 18 vzorky nádorů v každé skupině a rozdíly mezi skupinami byly statisticky významné.
3. Toto je pilotní průzkumná studie a pracovní hypotéza se může ukázat jako mylná; je proto zásadní omezit počáteční náklady v souladu s rozpočtem studie a dostupností odborných znalostí Dr. Huttera. Pokud je naše hypotéza podpořena počátečními výsledky, můžeme přistoupit k dalším šetřením a propracovanějšímu výzkumnému projektu s odpovídajícími finančními zdroji.¨ Z těchto důvodů omezíme náš výzkum na tři centra SHCS. Curych, Ženeva a Lausanne byly vybrány v podstatě na základě existujícího vztahu mezi jednotkami viscerální chirurgie.

Analýza dat:

Stav MSI nádorů bude hodnocen Pierrem Hutterem. Výsledky pak budou korelovány s epidemiologickými údaji ze švýcarské kohorty a korelovány s klinickými charakteristikami pacientů, včetně virové nálože, počtu CD4+ a také klinického výsledku. Výsledky budou také korelovány s výsledkem léčby a přežitím rakoviny.

Časové okno:

Vzorek nádoru bude odebrán z patologických oddělení v Lausanne, Ženevě a Curychu na začátku roku 2009. Analýza MSI je jednoduchý postup, který v laboratoři Dr. Huttera trvá asi 24 hodin. To znamená, že analýza 15 vzorků v HIV pozitivní populaci bude dokončena do konce března 2009. Další rozhodnutí týkající se následných analýz v HIV-negativní populaci pak bude předmětem rozhodnutí podle výsledků získaných u těchto počátečních nádorů.

Stav etického schválení:

Pacienti zařazení do švýcarské kohortové studie HIV původně dali svůj souhlas s účastí na tomto typu studie. Téměř všichni pacienti v HIV centrech souhlasili s účastí na genetickém výzkumu s cílem identifikovat specifické faktory, které by mohly vést k rozdílům v průběhu onemocnění. Je zřejmé, že všechny analýzy budou provedeny na vzorku nádoru a nebude možné vysledovat totožnost pacientů. Veškeré genetické testování tak bude zcela anonymní. Naproti tomu bude požadováno další schválení místní etickou komisí v Ženevě, bude-li analýza prováděna na vzorku nádoru od HIV-negativních pacientů.

Rozpočet na studium:

Prvotní analýzu 15 HIV pozitivních pacientů provede zdarma Pierre Hutter. Náklady na molekulární studii se odhadují na 250,-CHF na případ. V případě, že analýza MSI v této skupině povede ke slibným výsledkům, odhaduje se, že náklady na analýzu u 12-15 HIV-negativních pacientů budou stát kolem 3 000,-CHF. Financování tohoto typu výzkumu bude k dispozici prostřednictvím Fonds de Service of the Department of Surgery at University Hospital Geneva.