Biologia molekularna raka odbytu u pacjentów zakażonych wirusem HIV

Tło:

W dobie wysoce aktywnej terapii antyretrowirusowej (HAART) częstość występowania wielu nowotworów pozostaje wyższa u osób zakażonych wirusem HIV niż w populacji ogólnej. Dotyczy to nie tylko nowotworów definiujących AIDS, takich jak mięsak Kaposiego czy chłoniak, ale także innych nowotworów, które stanowią 58% wszystkich nowotworów w niedawno opisanej kohorcie w USA [1]. Tendencja ta wywołała ponowne zainteresowanie zrozumieniem molekularnych mechanizmów karcynogenezy u pacjentów z obniżoną odpornością. Potencjalne wyjaśnienia obejmują przedłużone przeżycie pacjentów zakażonych wirusem HIV stosujących HAART, wysoką częstość koinfekcji wirusami onkogennymi oraz narażenie na ryzyko, takie jak palenie tytoniu i alkohol [2].

Rak płaskonabłonkowy odbytu (SCCA) wymaga integracji DNA wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) z chromosomami komórek kanału odbytu. Mężczyźni zakażeni wirusem HIV są narażeni na zwiększone ryzyko zachorowania na raka odbytu. Szwajcarskie badanie łączące szwajcarskie badanie kohortowe HIV i szwajcarskie kantonalne rejestry raka wykazało znacznie podwyższone SIR dla raka odbytu (SIR = 33,4, 95% przedział ufności = 10,5-78,6) [3]. Oczywiście koinfekcja HPV-HIV odgrywa główną rolę w rozwoju SCCA, ale czy ten udział jest związany z odrębnym molekularnym szlakiem karcynogenezy, pozostaje hipotetyczny [4].

Rak odbytu występuje wcześniej u osób zakażonych wirusem HIV (średni wiek 37 lat) w porównaniu z zakażonymi wirusem HIV mężczyznami (58 lat) i kobietami zakażonymi wirusem HIV (65 lat). Ta różnica dwóch dekad w wieku zachorowania potwierdza hipotezę, że biologia SCCA różni się między pacjentami HIV-dodatnimi i HIV-ujemnymi [5]. Wpływ zakażenia HIV na naturalną historię zakażenia HPV odbytu jest słabo poznany, ale większość ekspertów zgadza się co do dwóch punktów: 1) 95% homoseksualnych mężczyzn zakażonych wirusem HIV jest jednocześnie zakażonych HPV; oraz 2) zakażenie HIV sprzyja utrzymywaniu się zakażenia HPV w obrębie dróg odbytowo-płciowych (szyjka macicy, pochwa i kanał odbytu).

W progresję raka zaangażowane są dwa główne i wzajemnie wykluczające się rodzaje niestabilności genomu. Pierwsza, znana jako niestabilność chromosomalna (CIN), wynika z szeregu zmian genetycznych, w tym aktywacji onkogenów i inaktywacji genów supresorowych nowotworów, takich jak p53 i APC. Druga, znana jako niestabilność mikrosatelitarna (MSI), wynika z somatycznej (nabytej) inaktywacji genów naprawy niedopasowań DNA (MMR), takich jak MLH1 (poprzez hipermetylację jej promotora), zazwyczaj prowadząc do mutacji genów z kodującymi mikrosatelitami, takimi jak BAT 25, BAT26 i CAT25, receptor transformującego czynnika wzrostu II (TGF-RII) oraz BAX [6].

MSI odzwierciedla niestabilność całego genomu (wynikającą z niedoboru systemu MMR) i występuje ze zwiększoną częstością w śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy i płuc związanej z HIV. W obu przypadkach częstość występowania MSI była sześciokrotnie większa w guzach związanych z HIV w porównaniu z guzami u pacjentów niezdeterminowanych HIV [7]. Inni autorzy również zgłaszali wysoki odsetek MSI w mięsakach Kaposiego i agresywnych chłoniakach uzyskanych od pacjentów zakażonych wirusem HIV, podczas gdy nie ma dowodów na podobną niestabilność zmian u pacjentów HIV-ujemnych [8]. Niedawna obserwacja, że ​​fenotyp MSI jest ograniczony do chłoniaków związanych z HIV sugeruje, że odporność gospodarza może w dużym stopniu wpływać na główną cechę raka, taką jak niestabilność genetyczna [9].

Status MSI SCCA u pacjentów zakażonych wirusem HIV nigdy nie był badany, ale przeprowadziliśmy analizę CIN próbek guzów od 18 pacjentów z HIV i 10 pacjentów z HIV, u których zdiagnozowano SCCA w dwóch amerykańskich instytucjach [10]. Guzy u pacjentów HIV-ujemnych częściej prezentowały CIN niż guzy u pacjentów HIV-dodatnich (24,1% w porównaniu z 6,6%, p <0,001). Konsekwentną utratę heterozygotyczności (LOH) na chromosomach 17p, 18q, 5q i 11q obserwowano u pacjentów HIV-ujemnych z SCCA. Natomiast utrata alleli w 17p, 5q i 18q była praktycznie nieobecna w guzach osób zakażonych wirusem HIV, co wskazuje, że supresja immunologiczna promuje progresję SCCA poprzez alternatywną ścieżkę do CIN.

Badania własne w terenie:

Skarżący jest chirurgiem jelita grubego, bezpośrednio zaangażowanym w leczenie pacjentów z nowotworami złośliwymi odbytnicy i odbytu od 2001 r. Zebrał wstępne dane pokazujące specyficzne wzorce aberracji molekularnych w SCCA związanym z HIV. Odkrycia te zostały opublikowane w recenzowanych czasopismach, w wyniku czego redaktorzy regularnie proszą wnioskodawcę o napisanie opinii ekspertów i przeglądów stanu wiedzy w tej dziedzinie.

Szwajcarska kohorta pacjentów zakażonych wirusem HIV zapewni wyjątkową okazję do przeprowadzenia tych badań ze względu na dużą liczbę osób już zapisanych w istniejącej bazie danych oraz istniejące doświadczenie w tej dziedzinie opracowane przez profesora Hirschela i jego zespół. Duża populacja pacjentów jest rzeczywiście warunkiem sine qua none rozpoczęcia tego projektu ze względu na względną rzadkość występowania tych nowotworów.

Wreszcie molekularny aspekt tych badań będzie prowadzony w laboratorium dr. Pierre'a Huttera, który jest liderem w naszym kraju w wykrywaniu dziedzicznego niezwiązanego z polipowatością raka jelita grubego (HNPCC). Tym samym laboratorium Dr Hutter zapewni doskonałe warunki do wykonywania opisanych tu analiz molekularnych.

Hipotezy badawcze:

Stawiamy hipotezę, że w populacji HIV niestabilność mikrosatelitarna, a nie niestabilność chromosomalna, jest preferowaną drogą szybkiego postępu śródnabłonkowej neoplazji odbytu w kierunku inwazyjnego SCCA. Druga hipoteza jest taka, że ​​dla porównania, MSI jest albo nieobecne, albo przynajmniej bardzo rzadkie w SCCA osób zakażonych wirusem HIV.

Cele i cele badania

Głównym celem tego badania jest ocena stanu niestabilności mikrosatelitarnej w próbkach guza 15 pacjentów zakażonych wirusem HIV z Kohorty Szwajcarskiej, u których zdiagnozowano SCCA; następnie zostanie przeprowadzona analiza tymczasowa w celu określenia częstości występowania MSI w SCCA u pacjentów zakażonych wirusem HIV. Jeśli w tej populacji większość guzów wykazuje MSI, przystąpimy do drugiej części badania, której celem jest wykonanie tych samych analiz w podobnych guzach 15 pacjentów HIV-ujemnych, a tym samym porównanie profili molekularnych SCCA w obie populacje. W ten sposób można ustalić potencjalną rolę supresji immunologicznej w progresji karcynogenezy.

Projekt i plan badania

Pacjenci:

Pacjenci ze szwajcarskiej kohorty HIV z potwierdzonym biopsją rozpoznaniem raka płaskonabłonkowego odbytu będą identyfikowani przy użyciu istniejącej bazy danych. Zdecydowaliśmy się przeanalizować co najmniej 15 próbek, w zależności od dostępności, między 3 ośrodkami SHCS. Guzy od pacjentów HIV-ujemnych, którzy przeszli operację SCCA, zostaną pobrane z Oddziału Patologii Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie do czasu przeglądu protokołu przez lokalną Komisję Etyki.

Interwencja:

Wszystkie próbki guza zostaną ponownie ocenione w celu potwierdzenia diagnozy przez patologa. Dla każdego pacjenta zostaną wybrane bloczki parafinowe zawierające zarówno tkankę nowotworową, jak i prawidłową błonę śluzową do ekstrakcji DNA i reakcji łańcuchowej polimerazy na docelowych mikrosatelitach. Tkanki rutynowo pobierano z sali operacyjnej, utrwalano w buforowanej formalinie, zatapiano w parafinie i przechowywano przez zmienną liczbę miesięcy przed selekcją do analizy. Bloki zatopione w parafinie zostaną pocięte mikrotomem na skrawki o grubości 20 µm. Używając sterylnego ostrza skalpela, obszary normalnej (nienowotworowej) i nowotworowej tkanki zostaną poddane mikrodysekcji pod mikroskopem preparacyjnym, wykorzystując skrawki barwione hematoksyliną i eozyną jako prowadnicę. Próbki zostaną odparafinowane w toluolu, oczyszczone etanolem absolutnym i odwirowane z prędkością 14 000 obr./min. Wcześniejsze doświadczenia w laboratorium dr Huttera pokazały, że technicznie możliwe jest przeprowadzenie tego typu analizy molekularnej w próbkach guza zatopionych w parafinie.

Wykorzystamy referencyjny panel starterów mikrosatelitarnych zalecanych dla próbek raka jelita grubego, aby określić obecność niestabilności mikrosatelitarnej w SCCA. Należą do nich markery mikrosatelitarne BAT25, BAT26, a także CAT25.

Oceny badań:

Wstępna ocena danych zostanie przeprowadzona po analizie pierwszych 15 próbek guzów. Jeśli MSI zostanie wykryty w populacji zakażonej wirusem HIV, dalsze badania zostaną przeprowadzone w guzach pacjentów zakażonych wirusem HIV. Analiza danych będzie przedmiotem raportów z postępów przeprowadzanych ze wszystkimi badaczami w regularnych odstępach czasu. Zdecydowaliśmy się ograniczyć, przynajmniej początkowo, naszą analizę do 15 guzów z trzech powodów:

1. Jest to stosunkowo rzadki nowotwór i jest mało prawdopodobne, abyśmy byli w stanie odzyskać więcej niż 25 pacjentów z SCCA ze szwajcarskiej kohorty HIV.
2. Nasze poprzednie badanie przeprowadzono z 18 próbkami guzów w każdej grupie, a różnice między grupami były statystycznie istotne.
3. Jest to pilotażowe badanie eksploracyjne, a hipoteza robocza może okazać się błędna; dlatego niezwykle ważne jest ograniczenie początkowych kosztów zgodnie z budżetem badania i dostępnością ekspertyzy dr Huttera. Jeśli wstępne wyniki potwierdzą naszą hipotezę, możemy przystąpić do dodatkowych badań i bardziej rozbudowanego projektu badawczego z odpowiednimi środkami finansowymi.¨ Z tych powodów ograniczymy nasze badania do trzech ośrodków SHCS. Zurych, Genewa i Lozanna zostały wybrane zasadniczo na podstawie istniejących relacji między jednostkami chirurgii wisceralnej.

Analiza danych:

Status MSI guzów zostanie oceniony przez Pierre'a Huttera. Wyniki zostaną następnie skorelowane z danymi epidemiologicznymi z kohorty szwajcarskiej i skorelowane z charakterystyką kliniczną pacjentów, w tym wiremią, liczbą komórek CD4+ oraz wynikami klinicznymi. Wyniki będą również skorelowane z wynikami leczenia i przeżyciem raka.

Ramy czasowe:

Próbki guza zostaną pobrane z Zakładów Patologii w Lozannie, Genewie i Zurychu na początku 2009 roku. Analiza MSI to prosta procedura, która trwa około 24 godzin w laboratorium dr Huttera. Tym samym analiza 15 próbek w populacji HIV-dodatnich zostanie zakończona do końca marca 2009 roku. Dalsza decyzja dotycząca kolejnych analiz w populacji HIV-ujemnej zostanie następnie podjęta zgodnie z wynikami uzyskanymi w tych początkowych guzach.

Status zatwierdzenia etycznego:

Pacjenci włączeni do szwajcarskiego badania kohortowego HIV początkowo wyrazili zgodę na udział w tego typu badaniu. Prawie wszyscy pacjenci w ośrodkach HIV wyrazili zgodę na udział w badaniach genetycznych w celu zidentyfikowania konkretnych czynników, które mogą powodować różnice w przebiegu choroby. Oczywiście wszystkie analizy będą wykonywane na próbkach guza, a te nie będą identyfikowalne z tożsamością pacjentów. W ten sposób wszystkie testy genetyczne będą całkowicie anonimowe. Z drugiej strony, jeśli analiza zostanie przeprowadzona na próbkach guza pobranych od pacjentów HIV-ujemnych, wymagana będzie dalsza zgoda lokalnej Komisji Etyki w Genewie.

Budżet studiów:

Wstępną analizę 15 pacjentów zakażonych wirusem HIV przeprowadzi bezpłatnie Pierre Hutter. Koszt badań molekularnych szacuje się na 250 CHF na przypadek. Tak więc, jeśli analiza MSI w tej grupie przyniesie obiecujące wyniki, szacuje się, że koszt analizy u 12-15 pacjentów HIV-ujemnych wyniesie około 3000 CHF. Fundusze na tego typu badania będą dostępne za pośrednictwem Fonds de Service na Wydziale Chirurgii Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie.