HIV 阳性患者肛门癌的分子生物学

背景：

在高效抗逆转录病毒疗法 (HAART) 时代，许多癌症在 HIV 阳性人群中的发病率仍然高于一般人群。 这不仅适用于定义为艾滋病的恶性肿瘤，例如卡波西肉瘤或淋巴瘤，而且适用于其他癌症，在最近描述的美国队列中占所有肿瘤的 58% [1]。 这种趋势重新引起了人们对了解免疫抑制患者致癌作用分子机制的兴趣。 可能的解释包括接受 HAART 的 HIV 患者存活时间延长、与致癌病毒合并感染的高发生率以及暴露于吸烟和饮酒等风险 [2]。

肛门鳞状细胞癌 (SCCA) 需要将人乳头瘤病毒 (HPV) DNA 整合到肛管细胞染色体中。 HIV 阳性男性患肛门癌的风险增加。 一项将瑞士 HIV 队列研究与瑞士各州癌症登记处联系起来的瑞士研究表明，肛门癌的 SIR 大大升高（SIR = 33.4， 95% 置信区间 = 10.5-78.6) [3]. 显然，HPV-HIV 合并感染在 SCCA 的发展中起着重要作用，但这种贡献是否与致癌作用的不同分子途径相关，仍然是假设性的 [4]。

与 HIV 阴性男性（58 岁）和 HIV 阴性女性（65 岁）相比，HIV 阳性个体（平均年龄 37 岁）发生肛门癌的时间更早。 这种 20 岁的发病年龄差异支持 SCCA 生物学在 HIV 阳性和 HIV 阴性患者之间存在差异的假设 [5]。 HIV 感染对肛门 HPV 感染自然史的影响知之甚少，但大多数专家同意两点：1）95% 的 HIV 阳性男同性恋者同时感染 HPV； 2) HIV 感染有利于 HPV 感染在肛门生殖道（子宫颈、阴道和肛管）内持续存在。

两种主要且相互排斥的基因组不稳定性类型与癌症进展有关。 第一种称为染色体不稳定性 (CIN)，由一系列遗传变化引起，包括致癌基因的激活和抑癌基因（如 p53 和 APC）的失活。 第二种称为微卫星不稳定性 (MSI)，由 MLH1 等 DNA 错配修复基因 (MMR) 的体细胞（获得性）失活（通过其启动子的超甲基化）引起，通常会导致编码微卫星的基因发生突变，例如BAT 25、BAT26 和 CAT25、转化生长因子受体 II (TGF-RII) 和 BAX [6]。

MSI 反映了全基因组的不稳定性（由缺陷的 MMR 系统引起），并且在 HIV 相关的宫颈上皮内和肺部肿瘤中发生的频率增加。 在这两种情况下，与 HIV 不确定患者的肿瘤相比，HIV 相关肿瘤的 MSI 频率高六倍 [7]。 其他作者也报道了从 HIV 感染患者获得的卡波西肉瘤和侵袭性淋巴瘤中的高 MSI 发生率，而没有证据表明来自 HIV 阴性患者的病变具有类似的不稳定性 [8]。 最近观察到 MSI 表型仅限于 HIV 相关淋巴瘤，这表明癌症的一个主要特征，例如遗传不稳定，可能会受到宿主免疫的高度影响 [9]。

从未研究过 HIV 阳性患者 SCCA 的 MSI 状态，但我们对美国两家机构诊断为 SCCA 的 18 名 HIV- 和 10 名 HIV+ 患者的肿瘤标本进行了 CIN 分析 [10]。 HIV 阴性患者的肿瘤比 HIV 阳性患者的肿瘤更可能出现 CIN（24.1% 对 6.6%，P<0.001）。 在患有 SCCA 的 HIV 阴性患者中观察到染色体 17p、18q、5q 和 11q 上的一致杂合性丢失 (LOH)。 相比之下，在 17p、5q 和 18q 处的等位基因丢失在 HIV 阳性个体的肿瘤中几乎不存在，表明免疫抑制通过替代途径促进 SCCA 进展为 CIN。

自己在该领域的研究：

申请人是结直肠外科医生，自2001年起直接参与肛肠恶性肿瘤患者的治疗。 他收集了显示 HIV 相关 SCCA 分子畸变特定模式的初步数据。 这些发现已发表在同行评审的期刊上，因此编辑会定期征求申请人撰写专家意见和该领域的最新评论。

瑞士 HIV 阳性患者队列将为开展这项研究提供独特的机会，因为现有数据库中已经登记了大量个体，并且 Hirschel 教授及其团队在该领域拥有现有的专业知识。 由于这些肿瘤相对罕见，大量患者确实是启动该项目的必要条件。

最后但同样重要的是，这项研究的分子方面将在 Pierre Hutter 博士的实验室进行，他是我国检测遗传性非息肉病性结直肠癌 (HNPCC) 的领导者。 因此，Hutter 博士实验室将为执行本文所述的分子分析提供极好的环境。

研究假设：

我们假设，在 HIV 人群中，微卫星不稳定性而不是染色体不稳定性是肛门上皮内瘤变向浸润性 SCCA 快速进展的有利途径。 第二个假设是，相比之下，MSI 在 HIV 阴性个体的 SCCA 中不存在或至少非常罕见。

研究目的和目标

本研究的主要目的是评估来自瑞士队列的 15 名被诊断患有 SCCA 的 HIV 阳性患者的肿瘤标本中的微卫星不稳定性状态；然后将进行中期分析以确定 HIV 阳性患者的 SCCA 中 MSI 的发生率。 如果大多数肿瘤在该人群中表现出 MSI，我们将继续研究的第二部分，目的是对 15 名 HIV 阴性患者的类似肿瘤进行相同的分析，从而比较 SCCA 的分子特征两个人口。 通过这样做，可能会确定免疫抑制在致癌过程中的潜在作用。

研究设计和计划

患者：

将使用现有数据库识别经活检证实诊断为肛门鳞状细胞癌的瑞士 HIV 队列患者。 我们选择在 3 个 SHCS 中心之间分析至少 15 个样本，具体取决于可用性。 接受 SCCA 手术的 HIV 阴性患者的肿瘤将从日内瓦大学医院病理学系取出，等待当地伦理委员会对该方案进行审查。

干涉：

病理学家将重新评估所有肿瘤样本以确认诊断。 对于每位患者，将选择具有肿瘤组织和正常粘膜的石蜡块用于微卫星靶标的 DNA 提取和聚合酶链反应。 这些组织通常从手术室收集，固定在缓冲的福尔马林中，包埋在石蜡中，并在选择进行分析之前储存不同的月数。 石蜡包埋块将用切片机切成 20 µm 厚的切片。 使用无菌手术刀刀片，正常（非肿瘤）和癌组织区域将在解剖显微镜下使用苏木精和伊红染色切片作为指导进行显微解剖。 样本将在甲苯中脱石蜡，用无水乙醇纯化，并以 14,000 rpm 离心。 Hutter 博士实验室的先前经验表明，在石蜡包埋的肿瘤标本中进行此类分子分析在技术上确实是可行的。

我们将使用推荐用于结直肠癌标本的微卫星引物参考组来确定 SCCA 中微卫星不稳定性的存在。 这些包括微卫星标记 BAT25、BAT26 以及 CAT25。

研究评估：

在对前 15 个肿瘤标本进行分析后，将对数据进行初步评估。 如果在 HIV 阳性人群中检测到 MSI，将对 HIV 阴性患者的肿瘤进行进一步调查。 数据分析将以定期与所有调查人员进行的进度报告为准。 出于以下三个原因，我们选择将我们的分析限制在 15 个肿瘤，至少在最初是这样：

1. 这是一种相对罕见的癌症，我们不太可能从瑞士 HIV 队列中检索到超过 25 名 SCCA 患者。
2. 我们之前的研究是用每组18个肿瘤标本进行的，组间差异有统计学意义。
3. 这是一项试点探索性研究，工作假设可能会被证明是错误的；因此，根据研究预算和 Hutter 博士专业知识的可用性来限制初始成本至关重要。 如果我们的假设得到初步结果的支持，我们可能会继续进行额外的调查和更详细的研究项目，并提供足够的资金资源。¨ 由于这些原因，我们将研究限制在三个 SHCS 中心。 苏黎世、日内瓦和洛桑的选择基本上是基于内脏外科部门之间的现有关系。

数据分析：

肿瘤的 MSI 状态将由 Pierre Hutter 评估。 然后将结果与瑞士队列的流行病学数据相关联，并与患者的临床特征相关联，包括病毒载量、CD4+ 计数以及临床结果。 结果还将与治疗结果和癌症存活率相关联。

大体时间：

肿瘤标本将于 2009 年初从洛桑、日内瓦和苏黎世的病理科取回。 MSI 分析是一个简单的过程，在 Hutter 博士的实验室中大约需要 24 小时。 至此，HIV阳性人群中的15份标本分析将于2009年3月底完成。 根据在这些初始肿瘤中获得的结果，将根据对 HIV 阴性人群的后续分析做出进一步决定。

道德批准的状态：

参加瑞士 HIV 队列研究的患者最初同意参与此类研究。 几乎所有 HIV 中心的患者都同意参加基因研究，以确定可能导致疾病进程差异的具体因素。 显然，所有分析都将在肿瘤标本上进行，而这些将无法追溯到患者的身份。 因此，所有基因检测都将完全匿名。 相比之下，如果对 HIV 阴性患者的肿瘤标本进行分析，将寻求日内瓦当地伦理委员会的进一步批准。

学习预算：

Pierre Hutter 将免费对 15 名 HIV 阳性患者进行初步分析。 分子研究的费用估计为每例 250.-CHF。 因此，如果对该组的 MSI 分析产生有希望的结果，估计 12-15 名 HIV 阴性患者的分析费用将花费大约 3,000.-CHF。 此类研究的资金将通过日内瓦大学医院外科的 Fonds de Service 提供。