Molekylærbiologi af anal kræft hos HIV-positive patienter

Baggrund:

I den højaktive antiretroviral terapi (HAART) æra er forekomsten af ​​mange kræftformer fortsat højere hos HIV-positive end i den generelle befolkning. Dette gælder ikke kun for AIDS-definerende maligniteter, såsom Kaposis sarkom eller lymfom, men også for andre kræftformer, som omfatter 58 % af alle neoplasmer i en nyligt beskrevet amerikansk kohorte [1]. Denne tendens har skabt fornyet interesse for at forstå de molekylære mekanismer af carcinogenese hos den immunsupprimerede patient. Potentielle forklaringer inkluderer forlænget overlevelse af patienter med HIV på HAART, høj forekomst af samtidig infektion med onkogene vira og eksponering for risici såsom rygning og alkohol [2].

Pladecellekarcinom i anus (SCCA) kræver integration af humant papillomavirus (HPV) DNA i analkanalens cellekromosomer. HIV-positive mænd har øget risiko for at udvikle analkræft. En schweizisk undersøgelse, der forbinder det schweiziske HIV-kohortestudie og schweiziske kantonalkræftregistre, har vist stærkt forhøjede SIR'er for analcancer (SIR = 33,4, 95 % CI = 10,5-78,6) [3]. Det er klart, at HPV-HIV co-infektion spiller en stor rolle i SCCA udvikling, men hvorvidt dette bidrag er forbundet med en særskilt molekylær vej for carcinogenese, forbliver hypotetisk [4].

Analkræft opstår tidligere hos HIV-positive personer (gennemsnitsalder 37 år) sammenlignet med HIV-negative mænd (58 år) og HIV-negative kvinder (65 år). Denne forskel på to årtier i debutalder understøtter hypotesen om, at biologien af ​​SCCA er forskellig mellem HIV-positive og HIV-negative patienter [5]. Virkningen af ​​HIV-infektion på den naturlige historie af anal HPV-infektion er dårligt forstået, men de fleste eksperter er enige om to punkter: 1) 95 % af HIV-positive homoseksuelle mænd er co-inficeret med HPV; og 2) HIV-infektion begunstiger vedvarende HPV-infektion i den ano-genitale kanal (livmoderhalsen, vagina og analkanalen).

To store og gensidigt eksklusive typer af genomisk ustabilitet er involveret i cancerprogression. Den første, kendt som kromosomal ustabilitet (CIN), er resultatet af en række genetiske ændringer, herunder aktivering af onkogener og inaktivering af tumor-suppressorgener såsom p53 og APC. Den anden, kendt som mikrosatellitinstabilitet (MSI), skyldes somatisk (erhvervet) inaktivering af DNA-mismatch reparationsgener (MMR), såsom MLH1 (ved hypermethylering af dets promotor), hvilket typisk fører til mutation af gener med kodende mikrosatellitter, som f.eks. BAT 25, BAT26 og CAT25, transformerende vækstfaktor receptor II (TGF-RII) og BAX [6].

MSI afspejler genomomspændende ustabilitet (som følge af et mangelfuldt MFR-system) og forekommer med øget hyppighed i HIV-associeret cervikal intraepitelial og lunge neoplasi. I begge tilfælde var frekvensen af ​​MSI seks gange større i de HIV-associerede tumorer sammenlignet med tumorer hos HIV-ubestemte patienter [7]. Andre forfattere har også rapporteret en høj grad af MSI i Kaposis sarkomer og aggressive lymfomer opnået fra HIV-inficerede patienter, hvorimod der ikke er tegn på lignende ustabilitet i læsioner fra HIV-negative patienter [8]. Den nylige observation af, at MSI-fænotypen er begrænset til HIV-relaterede lymfomer, tyder på, at et kardinaltræk ved kræft, såsom genetisk ustabilitet, kan være stærkt påvirket af værtsimmunitet [9].

MSI-status for SCCA hos HIV-positive patienter er aldrig blevet undersøgt, men vi har udført en CIN-analyse af tumorprøver fra 18 HIV- og 10 HIV+-patienter diagnosticeret med SCCA i to amerikanske institutioner [10]. Tumorer hos HIV-negative patienter var mere tilbøjelige til at præsentere CIN end tumorer hos HIV-positive patienter (24,1 % versus 6,6 %, P<0,001). Konsekvent tab af heterozygositet (LOH) på kromosomerne 17p, 18q, 5q og 11q blev observeret hos HIV-negative patienter med SCCA. Derimod var alleltab ved 17p, 5q og 18q praktisk talt fraværende i tumorer fra HIV-positive individer, hvilket indikerer, at immunsuppression fremmer SCCA-progression gennem en alternativ vej til CIN.

Egen forskning på området:

Ansøgeren er kolorektalkirurg, direkte involveret i behandlingen af ​​patienter med anorektale maligniteter siden 2001. Han har indsamlet foreløbige data, der viser specifikke mønstre af molekylære aberrationer i HIV-relateret SCCA. Disse resultater er blevet publiceret i peer-reviewede tidsskrifter, med den konsekvens, at ansøgeren regelmæssigt bliver opfordret af redaktører til at skrive ekspertudtalelser og state-of-the-art anmeldelser på området.

Den schweiziske kohorte af hiv-positive patienter vil give en unik mulighed for at udføre denne forskning på grund af det store antal personer, der allerede er tilmeldt den eksisterende database, og den eksisterende ekspertise på området udviklet af professor Hirschel og hans team. En stor population af patienter er faktisk en uundværlig betingelse for at starte dette projekt på grund af disse tumorers relative sjældenhed.

Sidst, men ikke mindst, vil det molekylære aspekt af denne forskning blive udført i laboratoriet af Dr. Pierre Hutter, PhD, som er førende i vores land for påvisning af arvelig non-polypose kolorektal cancer (HNPCC). Dr. Hutter laboratorium vil således give et fremragende miljø til at udføre de molekylære analyser beskrevet heri.

Studiehypoteser:

Vi antager, at mikrosatellit-ustabilitet i HIV-populationen snarere end kromosomal ustabilitet er den foretrukne vej til hurtig progression af anal intra-epitelial neoplasi mod invasiv SCCA. Den anden hypotese er, at til sammenligning er MSI enten fraværende eller i det mindste meget sjælden ved SCCA hos HIV-negative individer.

Studiemål og -mål

Det primære formål med denne undersøgelse er at vurdere mikrosatellit-ustabilitetsstatus i tumorprøver fra 15 HIV-positive patienter fra den schweiziske kohorte, som blev diagnosticeret med SCCA; en foreløbig analyse vil derefter blive udført for at bestemme forekomsten af ​​MSI i SCCA hos HIV-positive patienter. Hvis et flertal af tumorer udviser MSI i denne population, vil vi fortsætte med anden del af undersøgelsen, som har til formål at udføre de samme analyser i lignende tumorer hos 15 HIV-negative patienter og dermed sammenligne de molekylære profiler af SCCA i begge befolkninger. Ved at gøre dette kan den potentielle rolle af immunsuppression i karcinogeneseprogression etableres.

Studie Design og Plan

Patienter:

Patienter fra den schweiziske HIV-kohorte med en biopsi-bevist diagnose af planocellulært karcinom i anus vil blive identificeret ved hjælp af den eksisterende database. Vi vælger at analysere mindst 15 prøver, afhængig af tilgængelighed, mellem 3 SHCS-centre. Tumorer fra HIV-negative patienter, der blev opereret for SCCA, vil blive hentet fra Patologiafdelingen på Universitetshospitalet i Genève, i afventning af gennemgang af protokollen af ​​den lokale etiske komité.

Intervention:

Alle tumorprøver vil blive revurderet for bekræftelse af diagnosen af ​​en patolog. For hver patient vil paraffinblokke med både tumorvæv og normal slimhinde blive udvalgt til DNA-ekstraktion og polymerasekædereaktion ved mikrosatellitmål. Vævene blev rutinemæssigt opsamlet fra operationsstuen, fikseret i bufret formalin, indlejret i paraffin og opbevaret i et variabelt antal måneder før udvælgelse til analyse. Paraffin-indlejrede blokke vil blive skåret med en mikrotom i 20 µm tykke sektioner. Ved hjælp af et sterilt skalpelblad vil områder af normalt (ikke-tumor) og cancervæv blive mikrodissekeret under et dissektionsmikroskop ved at bruge en hæmatoxylin- og eosinfarvet sektion som vejledning. Prøverne afparaffineres i toluol, renses med absolut ethanol og centrifugeres ved 14.000 rpm. Tidligere erfaring i Dr. Hutters laboratorium har vist, at det rent faktisk er teknisk muligt at udføre denne type molekylær analyse i paraffinindlejrede tumorprøver.

Vi vil bruge referencepanelet af mikrosatellitprimere anbefalet til kolorektal cancerprøver til at bestemme tilstedeværelsen af ​​mikrosatellit-ustabilitet i SCCA. Disse omfatter mikrosatellitmarkørerne BAT25, BAT26 samt CAT25.

Studieevalueringer:

Indledende evaluering af data vil blive udført efter analyse af de første 15 tumorprøver. Hvis der påvises MSI i den HIV-positive population, vil der blive udført yderligere undersøgelser i tumorer fra HIV-negative patienter. Dataanalyse vil med jævne mellemrum være underlagt fremskridtsrapporter med alle efterforskere. Vi valgte i det mindste i begyndelsen at begrænse vores analyse til 15 tumorer af tre grunde:

1. Dette er en relativt sjælden kræftsygdom, og det er usandsynligt, at vi vil være i stand til at hente mere end 25 SCCA-patienter fra den schweiziske HIV-kohorte.
2. Vores tidligere undersøgelse blev udført med 18 tumorprøver i hver gruppe, og forskellene mellem grupperne var statistisk signifikante.
3. Dette er et pilotforsøg, og arbejdshypotesen kan vise sig at være forkert; det er derfor afgørende at begrænse de indledende omkostninger i overensstemmelse med studiebudgettet og tilgængeligheden af ​​Dr. Hutters ekspertise. Hvis vores hypotese understøttes af de første resultater, kan vi fortsætte med yderligere undersøgelser og et mere uddybet forskningsprojekt med tilstrækkelige finansieringsressourcer.¨ Af disse grunde vil vi begrænse vores forskning til tre SHCS-centre. Zürich, Genève og Lausanne blev valgt i det væsentlige baseret på eksisterende forhold mellem de viscerale kirurgi-enheder.

Dataanalyse:

MSI-status for tumorer vil blive vurderet af Pierre Hutter. Resultaterne vil derefter blive korreleret med de epidemiologiske data fra den schweiziske kohorte, og korreleret med patienternes kliniske karakteristika, herunder viral load, CD4+-tal samt klinisk resultat. Resultaterne vil også blive korreleret med behandlingsresultat og kræftoverlevelse.

Tidsramme:

Tumorprøver vil blive hentet fra afdelingerne for patologi i Lausanne, Genève og Zürich i begyndelsen af ​​2009. MSI-analysen er en ligetil procedure, som tager omkring 24 timer i Dr. Hutters laboratorium. Analysen af ​​de 15 prøver i den hiv-positive population vil således være afsluttet ved udgangen af ​​marts 2009. Yderligere beslutninger vedrørende efterfølgende analyser i den HIV-negative population vil derefter blive underlagt beslutning i henhold til resultaterne opnået i disse initiale tumorer.

Status for etisk godkendelse:

Patienter indskrevet i det schweiziske HIV-kohortestudie gav oprindeligt deres samtykke til at deltage i denne type undersøgelse. Næsten alle patienter på hiv-centrene gav samtykke til at deltage i genetisk forskning for at identificere specifikke faktorer, der kunne resultere i forskelle i sygdomsforløbet. Det er klart, at alle analyser vil blive udført på tumorprøver, og disse vil ikke kunne spores til patienternes identitet. Således vil al genetisk testning være fuldstændig anonym. Derimod vil der blive søgt yderligere godkendelse af den lokale etiske komité i Genève, hvis analysen udføres på tumorprøver fra HIV-negative patienter.

Studiebudget:

Den indledende analyse af 15 hiv-positive patienter vil blive udført gratis af Pierre Hutter. Omkostningerne til molekylær undersøgelse er anslået til 250.-CHF pr. sag. Såfremt analysen af ​​MSI i denne gruppe fører til lovende resultater, anslås det, at analyseomkostningerne hos 12-15 HIV-negative patienter vil koste omkring 3.000.-CHF. Finansiering til denne type forskning vil være tilgængelig gennem Fonds de Service of Department of Surgery på University Hospital Geneve.