Biologia Molecular do Câncer Anal em Pacientes HIV Positivos

Fundo:

Na era da terapia antirretroviral altamente ativa (HAART), a incidência de muitos tipos de câncer permanece mais alta nos HIV positivos do que na população em geral. Isso não é verdade apenas para malignidades definidoras de AIDS, como sarcoma de Kaposi ou linfoma, mas também para outros tipos de câncer, que compreendem 58% de todas as neoplasias em uma coorte americana recentemente descrita [1]. Esta tendência gerou interesse renovado na compreensão dos mecanismos moleculares da carcinogênese no paciente imunossuprimido. As explicações potenciais incluem a sobrevida prolongada de pacientes com HIV em HAART, alta incidência de co-infecção com vírus oncogênicos e exposição a riscos como tabagismo e álcool [2].

O carcinoma de células escamosas do ânus (SCCA) requer a integração do DNA do papilomavírus humano (HPV) nos cromossomos das células do canal anal. Homens HIV positivos têm maior risco de desenvolver câncer anal. Um estudo suíço que liga o estudo de coorte suíço de HIV e os registros cantonais suíços de câncer mostrou SIRs muito elevados para câncer anal (SIR = 33,4, 95% CI = 10,5-78,6) [3]. Claramente, a coinfecção HPV-HIV desempenha um papel importante no desenvolvimento da SCCA, mas se essa contribuição está associada a uma via molecular distinta da carcinogênese, permanece hipotético [4].

O câncer anal ocorre mais cedo em indivíduos HIV positivos (idade média de 37 anos) em comparação com homens HIV negativos (58 anos) e mulheres HIV negativos (65 anos). Esta diferença de duas décadas na idade de início suporta a hipótese de que a biologia da SCCA difere entre pacientes HIV-positivos e HIV-negativos [5]. O efeito da infecção pelo HIV na história natural da infecção anal pelo HPV é mal compreendido, mas a maioria dos especialistas concorda em dois pontos: 1) 95% dos homens homossexuais HIV-positivos estão co-infectados pelo HPV; e 2) a infecção pelo HIV favorece a persistência da infecção pelo HPV no trato anogenital (colo do útero, vagina e canal anal).

Dois tipos principais e mutuamente exclusivos de instabilidade genômica estão envolvidos na progressão do câncer. A primeira, conhecida como instabilidade cromossômica (NIC), resulta de uma série de alterações genéticas, incluindo ativação de oncogenes e inativação de genes supressores de tumor, como p53 e APC. A segunda, conhecida como instabilidade de microssatélites (MSI), resulta da inativação somática (adquirida) de genes de reparo de incompatibilidade de DNA (MMR), como MLH1 (por hipermetilação de seu promotor), normalmente levando à mutação de genes com microssatélites codificantes, como BAT 25, BAT26 e CAT25, transformando o receptor do fator de crescimento II (TGF-RII) e BAX [6].

A MSI reflete a instabilidade genômica (resultante de um sistema MMR deficiente) e ocorre com maior frequência em neoplasias pulmonares e intraepiteliais cervicais associadas ao HIV. Em ambos os casos, a frequência de MSI foi seis vezes maior nos tumores associados ao HIV, em comparação com tumores de pacientes HIV indeterminados [7]. Outros autores também relataram uma alta taxa de MSI em sarcomas de Kaposi e linfomas agressivos obtidos de pacientes infectados pelo HIV, enquanto não há evidência de instabilidade semelhante em lesões de pacientes HIV negativos [8]. A observação recente de que o fenótipo MSI é restrito a linfomas relacionados ao HIV sugere que uma característica fundamental do câncer, como a instabilidade genética, pode ser altamente influenciada pela imunidade do hospedeiro [9].

O status MSI de SCCA em pacientes HIV-positivos nunca foi investigado, mas realizamos uma análise CIN de espécimes tumorais de 18 pacientes HIV- e 10 HIV+ diagnosticados com SCCA em duas instituições dos EUA [10]. Tumores em pacientes HIV negativos eram mais propensos a apresentar NIC do que tumores em pacientes HIV positivos (24,1% versus 6,6%, P<0,001). Perda consistente de heterozigosidade (LOH) nos cromossomos 17p, 18q, 5q e 11q foi observada em pacientes HIV negativos com SCCA. Em contraste, a perda alélica em 17p, 5q e 18q foi virtualmente ausente em tumores de indivíduos HIV positivos, indicando que a imunossupressão promove a progressão da SCCA através de uma via alternativa para NIC.

Pesquisa Própria na Área:

O requerente é um cirurgião colorretal, diretamente envolvido no tratamento de pacientes com malignidades anorretais desde 2001. Ele coletou dados preliminares mostrando padrões específicos de aberrações moleculares em SCCA relacionadas ao HIV. Essas descobertas foram publicadas em periódicos revisados ​​por pares, com a consequência de que o candidato é regularmente solicitado pelos editores a escrever opiniões de especialistas e análises de última geração no campo.

A coorte suíça de pacientes HIV positivos proporcionará uma oportunidade única para conduzir esta pesquisa, devido ao grande número de indivíduos já inscritos no banco de dados existente e à experiência existente no campo desenvolvida pelo professor Hirschel e sua equipe. Uma grande população de pacientes é de fato uma condição sine qua none para iniciar este projeto devido à relativa raridade desses tumores.

Por último, mas não menos importante, o aspecto molecular desta pesquisa será conduzido no laboratório do Dr. Pierre Hutter, PhD, que é líder em nosso país na detecção de câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC). Assim, o laboratório do Dr. Hutter proporcionará um excelente ambiente para a realização das análises moleculares aqui descritas.

Hipóteses de estudo:

Nossa hipótese é que, na população com HIV, a instabilidade de microssatélites, em vez da instabilidade cromossômica, é a via preferida para a rápida progressão da neoplasia intra-epitelial anal para SCCA invasiva. A segunda hipótese é que, em comparação, MSI está ausente ou pelo menos muito raro em SCCA de indivíduos HIV-negativos.

Alvos e Objetivos do Estudo

O objetivo principal deste estudo é avaliar o estado de instabilidade de microssatélites em amostras tumorais de 15 pacientes HIV-positivos da coorte suíça que foram diagnosticados com SCCA; uma análise interina será então realizada para determinar a incidência de MSI em SCCA de pacientes HIV-positivos. Se a maioria dos tumores apresenta MSI nesta população, prosseguiremos para a segunda parte do estudo, cujo objetivo é realizar as mesmas análises em tumores semelhantes de 15 pacientes HIV negativos e, assim, comparar os perfis moleculares de SCCA em ambas as populações. Ao fazer isso, o papel potencial da imunossupressão na progressão da carcinogênese pode ser estabelecido.

Projeto e Plano de Estudo

Pacientes:

Os pacientes da coorte suíça de HIV com diagnóstico comprovado por biópsia de carcinoma de células escamosas do ânus serão identificados usando o banco de dados existente. Optamos por analisar pelo menos 15 amostras, dependendo da disponibilidade, entre 3 centros SHCS. Tumores de pacientes HIV-negativos submetidos à cirurgia para SCCA serão recuperados do Departamento de Patologia do Hospital Universitário de Genebra, enquanto se aguarda a revisão do protocolo pelo Comitê de Ética local.

Intervenção:

Todas as amostras do tumor serão reavaliadas para confirmação do diagnóstico por um patologista. Para cada paciente, blocos de parafina com tecido tumoral e mucosa normal serão selecionados para extração de DNA e reação em cadeia da polimerase em alvos microssatélites. Os tecidos foram coletados rotineiramente na sala de cirurgia, fixados em formalina tamponada, embebidos em parafina e armazenados por um número variável de meses antes da seleção para análise. Os blocos embebidos em parafina serão cortados com um micrótomo em seções de 20 µm de espessura. Usando uma lâmina de bisturi estéril, as áreas de tecido normal (não tumoral) e cancerígeno serão microdissecadas sob um microscópio de dissecação utilizando uma seção manchada com hematoxilina e eosina como guia. Os espécimes serão desparafinizados em toluol, purificados com etanol absoluto e centrifugados a 14.000 rpm. A experiência anterior no laboratório do Dr. Hutter demonstrou que é realmente tecnicamente possível realizar este tipo de análise molecular em espécimes tumorais embebidos em parafina.

Usaremos o painel de referência de primers de microssatélites recomendados para espécimes de câncer colorretal para determinar a presença de instabilidade de microssatélites em SCCA. Estes incluem os marcadores microssatélites BAT25, BAT26, bem como CAT25.

Avaliações de estudo:

A avaliação inicial dos dados será realizada após a análise das primeiras 15 amostras de tumores. Se a MSI for detectada na população HIV positiva, uma investigação mais aprofundada será realizada em tumores de pacientes HIV negativos. A análise de dados estará sujeita a relatórios de progresso conduzidos com todos os investigadores em intervalos regulares. Optamos por restringir, pelo menos inicialmente, nossa análise a 15 tumores por três motivos:

1. Este é um câncer relativamente raro e é improvável que consigamos recuperar mais de 25 pacientes com SCCA da coorte suíça de HIV.
2. Nosso estudo anterior foi realizado com 18 espécimes de tumores em cada grupo, e as diferenças entre os grupos foram estatisticamente significativas.
3. Este é um estudo exploratório piloto, e a hipótese de trabalho pode estar errada; portanto, é fundamental limitar os custos iniciais de acordo com o orçamento do estudo e a disponibilidade da experiência do Dr. Hutter. Se nossa hipótese for suportada pelos resultados iniciais, podemos prosseguir com investigações adicionais e um projeto de pesquisa mais elaborado com recursos de financiamento adequados.¨ Por esses motivos, restringiremos nossa pesquisa a três centros da SHCS. Zurique, Genebra e Lausanne foram escolhidas essencialmente com base na relação existente entre as unidades de cirurgia visceral.

Análise de dados:

O status do MSI dos tumores será avaliado por Pierre Hutter. Os resultados serão então correlacionados com os dados epidemiológicos da coorte suíça e correlacionados com as características clínicas dos pacientes, incluindo carga viral, contagem de CD4+, bem como evolução clínica. Os resultados também serão correlacionados com o resultado do tratamento e sobrevida ao câncer.

Prazo:

A amostra do tumor será retirada dos Departamentos de Patologia de Lausanne, Genebra e Zurique no início de 2009. A análise MSI é um procedimento simples, que leva cerca de 24 horas no laboratório do Dr. Hutter. Assim, a análise das 15 amostras da população seropositiva estará concluída até ao final de Março de 2009. A decisão posterior sobre as análises subsequentes na população HIV negativa será então submetida a decisão, de acordo com os resultados obtidos nesses tumores iniciais.

Status de Aprovação Ética:

Os pacientes inscritos no estudo suíço de coorte de HIV inicialmente deram seu consentimento para participar desse tipo de estudo. Quase todos os pacientes dos centros de HIV consentiram em participar de pesquisas genéticas para identificar fatores específicos que pudessem resultar em diferenças no curso da doença. Obviamente, todas as análises serão realizadas em espécimes tumorais, e estes não serão rastreáveis ​​às identidades dos pacientes. Assim, todos os testes genéticos serão totalmente anônimos. Por outro lado, será solicitada a aprovação do Comitê de Ética local em Genebra, caso a análise seja realizada em amostras de tumores de pacientes HIV negativos.

Orçamento do estudo:

A análise inicial de 15 pacientes HIV positivos será realizada gratuitamente por Pierre Hutter. O custo do estudo molecular é estimado em 250.-CHF por caso. Assim, caso a análise de MSI neste grupo conduza a resultados promissores, estima-se que o custo da análise em 12-15 doentes seronegativos custará cerca de 3.000,-CHF. Financiamento para este tipo de pesquisa estará disponível através do Fonds de Service do Departamento de Cirurgia do Hospital Universitário de Genebra.