Molecular Biology of Anal Cancer hos HIV-positiva patienter

Bakgrund:

I eran av högaktiv antiretroviral terapi (HAART) är förekomsten av många cancerformer fortfarande högre hos hiv-positiva än i den allmänna befolkningen. Detta gäller inte bara för AIDS-definierande maligniteter, såsom Kaposis sarkom eller lymfom, utan också för andra cancerformer, som utgör 58 % av alla neoplasmer i en nyligen beskriven amerikansk kohort [1]. Denna trend har genererat förnyat intresse för att förstå de molekylära mekanismerna för karcinogenes hos den immunsupprimerade patienten. Potentiella förklaringar inkluderar förlängd överlevnad av patienter med HIV på HAART, hög förekomst av samtidig infektion med onkogena virus och exponering för risker som rökning och alkohol [2].

Skivepitelcancer i anus (SCCA) kräver integrering av humant papillomvirus (HPV) DNA i analkanalens cellkromosomer. HIV-positiva män löper ökad risk att utveckla analcancer. En schweizisk studie som kopplar samman den schweiziska HIV-kohortstudien och schweiziska kantonala cancerregister har visat kraftigt förhöjda SIR för analcancer (SIR = 33,4, 95 % KI = 10,5-78,6) [3]. Uppenbarligen spelar HPV-HIV-saminfektion en viktig roll i utvecklingen av SCCA, men huruvida detta bidrag är associerat med distinkt molekylär väg för karcinogenes är fortfarande hypotetiskt [4].

Analcancer uppträder tidigare hos hiv-positiva individer (medelålder 37 år) jämfört med hiv-negativa män (58 år) och hiv-negativa kvinnor (65 år). Denna skillnad på två decennier i debutålder stöder hypotesen att biologin av SCCA skiljer sig mellan HIV-positiva och HIV-negativa patienter [5]. Effekten av HIV-infektion på den naturliga historien av anal HPV-infektion är dåligt förstådd, men de flesta experter är överens om två punkter: 1) 95 % av HIV-positiva homosexuella män är samtidigt infekterade med HPV; och 2) HIV-infektion gynnar ihållande HPV-infektion i det ano-genitala området (livmoderhalsen, vagina och analkanalen).

Två stora och ömsesidigt uteslutande typer av genomisk instabilitet är involverade i cancerprogression. Den första, känd som kromosomal instabilitet (CIN), är resultatet av en serie genetiska förändringar, inklusive aktivering av onkogener och inaktivering av tumörsuppressorgener såsom p53 och APC. Den andra, känd som mikrosatellitinstabilitet (MSI), är resultatet av somatisk (förvärvad) inaktivering av DNA-felmatchningsreparationsgener (MMR), såsom MLH1 (genom hypermetylering av dess promotor), vilket vanligtvis leder till mutation av gener med kodande mikrosatelliter, som t.ex. BAT 25, BAT26 och CAT25, transformerande tillväxtfaktorreceptor II (TGF-RII) och BAX [6].

MSI återspeglar genomomfattande instabilitet (som ett resultat av ett bristfälligt MMR-system) och förekommer med ökad frekvens vid HIV-associerad cervikal intraepitelial och lungneoplasi. I båda fallen var frekvensen av MSI sex gånger högre i HIV-associerade tumörer, jämfört med tumörer hos HIV-obestämda patienter [7]. Andra författare har också rapporterat en hög frekvens av MSI i Kaposis sarkom och aggressiva lymfom erhållna från HIV-infekterade patienter, medan det inte finns några bevis för liknande instabilitet i lesioner från HIV-negativa patienter [8]. Den senaste observationen att MSI-fenotypen är begränsad till HIV-relaterade lymfom tyder på att en kardinal egenskap hos cancer, såsom genetisk instabilitet, kan påverkas starkt av värdimmunitet [9].

MSI-status för SCCA hos HIV-positiva patienter har aldrig undersökts, men vi har utfört en CIN-analys av tumörprover från 18 HIV- och 10 HIV+-patienter diagnostiserade med SCCA i två amerikanska institutioner [10]. Tumörer hos HIV-negativa patienter var mer benägna att uppvisa CIN än tumörer hos HIV-positiva patienter (24,1 % mot 6,6 %, P<0,001). Konsekvent förlust av heterozygositet (LOH) på kromosomerna 17p, 18q, 5q och 11q observerades hos HIV-negativa patienter med SCCA. Däremot var allelförlust vid 17p, 5q och 18q praktiskt taget frånvarande i tumörer hos HIV-positiva individer, vilket indikerar att immunsuppression främjar SCCA-progression genom en alternativ väg till CIN.

Egen forskning inom området:

Sökanden är en kolorektalkirurg, direkt involverad i behandlingen av patienter med anorektala maligniteter sedan 2001. Han har samlat in preliminära data som visar specifika mönster av molekylära aberrationer i HIV-relaterad SCCA. Dessa resultat har publicerats i peer-reviewed tidskrifter, med konsekvensen att sökanden regelbundet uppmanas av redaktörer att skriva expertutlåtanden och toppmoderna recensioner inom området.

Den schweiziska kohorten av hiv-positiva patienter kommer att ge en unik möjlighet att genomföra denna forskning, på grund av det stora antalet individer som redan är inskrivna i den befintliga databasen och den befintliga expertis inom området utvecklad av professor Hirschel och hans team. En stor population av patienter är verkligen ett absolut villkor för att starta detta projekt på grund av dessa tumörers relativa sällsynthet.

Sist men inte minst kommer den molekylära aspekten av denna forskning att genomföras i laboratoriet av Dr Pierre Hutter, PhD, som är ledande i vårt land för detektion av ärftlig icke-polypos kolorektal cancer (HNPCC). Således kommer Dr Hutter-laboratoriet att tillhandahålla en utmärkt miljö för att utföra de molekylära analyser som beskrivs häri.

Studiehypoteser:

Vi antar att i HIV-populationen är mikrosatellitinstabilitet, snarare än kromosomal instabilitet, den gynnade vägen för snabb progression av anal intraepitelial neoplasi mot invasiv SCCA. Den andra hypotesen är att i jämförelse är MSI antingen frånvarande eller åtminstone mycket sällsynt vid SCCA hos HIV-negativa individer.

Studiemål och mål

Det primära syftet med denna studie är att bedöma mikrosatellitinstabilitetsstatus i tumörprover från 15 HIV-positiva patienter från den schweiziska kohorten som diagnostiserades med SCCA; en interimsanalys kommer sedan att utföras för att fastställa förekomsten av MSI i SCCA hos HIV-positiva patienter. Om en majoritet av tumörerna uppvisar MSI i denna population kommer vi att fortsätta med den andra delen av studien, vars mål är att utföra samma analyser i liknande tumörer hos 15 HIV-negativa patienter, och därmed att jämföra de molekylära profilerna för SCCA i båda populationerna. Genom att göra det kan den potentiella rollen av immunsuppression i karcinogenesförloppet fastställas.

Studera Design och Plan

Patienter:

Patienter från den schweiziska HIV-kohorten med en biopsibeprövad diagnos av skivepitelcancer i anus kommer att identifieras med hjälp av den befintliga databasen. Vi väljer att analysera minst 15 prover, beroende på tillgänglighet, mellan 3 SHCS-centra. Tumörer från HIV-negativa patienter som genomgått operation för SCCA kommer att hämtas från avdelningen för patologi vid universitetssjukhuset i Genève, i väntan på granskning av protokollet av den lokala etiska kommittén.

Intervention:

Alla tumörprover kommer att omvärderas för bekräftelse av diagnos av en patolog. För varje patient kommer paraffinblock med både tumörvävnad och normal slemhinna att väljas för DNA-extraktion och polymeraskedjereaktion vid mikrosatellitmål. Vävnaderna samlades rutinmässigt upp från operationssalen, fixerades i buffrat formalin, bäddades in i paraffin och lagrades i ett varierande antal månader innan urvalet för analys. Paraffininbäddade block kommer att skäras med en mikrotom i 20 µm tjocka sektioner. Med hjälp av ett sterilt skalpellblad kommer områden av normal (icke-tumör) och cancervävnad att mikrodissekeras under ett dissekerande mikroskop med användning av en hematoxylin- och eosinfärgad sektion som vägledning. Proverna kommer att avparaffineras i toluol, renas med absolut etanol och centrifugeras vid 14 000 rpm. Tidigare erfarenhet i Dr Hutters laboratorium har visat att det verkligen är tekniskt möjligt att utföra denna typ av molekylär analys i paraffininbäddade tumörprover.

Vi kommer att använda referenspanelen med mikrosatellitprimrar som rekommenderas för kolorektalcancerprover för att bestämma närvaron av mikrosatellitinstabilitet i SCCA. Dessa inkluderar mikrosatellitmarkörerna BAT25, BAT26, såväl som CAT25.

Studieutvärderingar:

Initial utvärdering av data kommer att utföras efter analys av de första 15 tumörproverna. Om MSI upptäcks i den HIV-positiva populationen kommer ytterligare undersökningar att genomföras i tumörer hos HIV-negativa patienter. Dataanalys kommer att bli föremål för framstegsrapporter som genomförs med alla utredare med jämna mellanrum. Vi valde att begränsa, åtminstone initialt, vår analys till 15 tumörer av tre skäl:

1. Detta är en relativt sällsynt cancersjukdom, och det är osannolikt att vi kommer att kunna hämta mer än 25 SCCA-patienter från den schweiziska HIV-kohorten.
2. Vår tidigare studie genomfördes med 18 tumörprover i varje grupp, och skillnaderna mellan grupperna var statistiskt signifikanta.
3. Detta är en pilotstudie, och arbetshypotesen kan visa sig vara felaktig; Det är därför viktigt att begränsa de initiala kostnaderna i enlighet med studiebudgeten och tillgången på Dr Hutters expertis. Om vår hypotes stöds av de första resultaten kan vi fortsätta med ytterligare undersökningar och ett mer genomarbetat forskningsprojekt med tillräckliga finansieringsresurser.¨ Av dessa skäl kommer vi att begränsa vår forskning till tre SHCS-centra. Zürich, Genève och Lausanne valdes huvudsakligen baserat på existerande förhållande mellan de viscerala kirurgiska enheterna.

Dataanalys:

MSI-status för tumörer kommer att bedömas av Pierre Hutter. Resultaten kommer sedan att korreleras med epidemiologiska data från den schweiziska kohorten, och korreleras med patienternas kliniska egenskaper, inklusive virusmängd, CD4+-antal, samt kliniskt utfall. Resultaten kommer också att korreleras med behandlingsresultat och canceröverlevnad.

Tidsram:

Tumörprov kommer att hämtas från avdelningarna för patologi i Lausanne, Genève och Zürich i början av 2009. MSI-analysen är en enkel procedur som tar cirka 24 timmar i Dr Hutters laboratorium. Analysen av de 15 proverna i den hiv-positiva populationen kommer således att vara klar i slutet av mars 2009. Ytterligare beslut om efterföljande analyser i den HIV-negativa populationen kommer sedan att bli föremål för beslut, enligt de resultat som erhållits i dessa initiala tumörer.

Status för etiskt godkännande:

Patienter som var inskrivna i den schweiziska hiv-kohortstudien gav först sitt samtycke till att delta i denna typ av studie. Nästan alla patienter vid hiv-centralerna samtyckte till att delta i genetisk forskning för att identifiera specifika faktorer som kan leda till skillnader i sjukdomsförloppet. Självklart kommer alla analyser att utföras på tumörprover, och dessa kommer inte att kunna spåras till patienternas identitet. Alltså kommer alla genetiska tester att vara helt anonyma. Däremot kommer ytterligare godkännande från den lokala etiska kommittén i Genève att sökas om analysen skulle utföras på tumörprover från HIV-negativa patienter.

Studiebudget:

Den första analysen av 15 HIV-positiva patienter kommer att utföras kostnadsfritt av Pierre Hutter. Kostnaden för molekylära studier uppskattas till 250.-CHF per fall. Således, om analysen av MSI i denna grupp leder till lovande resultat, beräknas kostnaden för analys av 12-15 HIV-negativa patienter kosta omkring 3 000.-CHF. Finansiering för denna typ av forskning kommer att vara tillgänglig genom Fonds de Service för kirurgiska avdelningen vid universitetssjukhuset i Genève.