HIV 陽性患者の肛門癌の分子生物学

バックグラウンド：

高活性抗レトロウイルス療法 (HAART) の時代においても、HIV 陽性者の多くのがんの発生率は依然として一般集団よりも高いままです。 これは、カポジ肉腫やリンパ腫などのエイズを定義する悪性腫瘍だけでなく、最近報告された米国コホートの全新生物の 58% を占める他の癌にも当てはまります [1]。 この傾向により、免疫抑制患者における発がんの分子機構を理解することへの新たな関心が高まっています。 考えられる説明としては、HAART を受けている HIV 患者の生存期間の延長、発がん性ウイルスによる同時感染の発生率の高さ、喫煙やアルコールなどのリスクへの曝露などが挙げられます [2]。

肛門扁平上皮癌 (SCCA) では、ヒトパピローマウイルス (HPV) DNA の肛門管細胞染色体への組み込みが必要です。 HIV 陽性の男性は肛門がんを発症するリスクが高くなります。 スイスのHIVコホート研究とスイスの州がん登録を結び付けたスイスの研究では、肛門がんのSIRが大幅に上昇していることが示された（SIR = 33.4、 95% CI = 10.5-78.6) [3]。 明らかに、HPV-HIV 同時感染が SCCA の発症に主要な役割を果たしていますが、この寄与が発癌の明確な分子経路と関連しているかどうかは仮説の段階です [4]。

肛門がんは、HIV 陰性の男性 (58 歳) や HIV 陰性の女性 (65 歳) と比較して、HIV 陽性の人 (平均年齢 37 歳) の方が早く発生します。 この発症年齢の 20 歳の差は、SCCA の生物学が HIV 陽性患者と HIV 陰性患者の間で異なるという仮説を裏付けています [5]。 肛門 HPV 感染の自然史に対する HIV 感染の影響はほとんど理解されていませんが、ほとんどの専門家は次の 2 つの点で同意しています。1) HIV 陽性同性愛男性の 95% は HPV に同時感染しています。 2) HIV 感染は、肛門生殖管 (子宮頸部、膣、および肛門管) 内での HPV 感染の持続を促進します。

がんの進行には、相互に排他的な 2 つの主要なタイプのゲノム不安定性が関与しています。 1 つ目は染色体不安定性 (CIN) として知られ、がん遺伝子の活性化や p53 や APC などの腫瘍抑制遺伝子の不活性化など、一連の遺伝的変化によって生じます。 2 つ目は、マイクロサテライト不安定性 (MSI) として知られ、MLH1 などの DNA ミスマッチ修復遺伝子 (MMR) の体細胞性 (後天性) 不活化 (プロモーターの過剰メチル化による) によって生じ、通常、次のようなマイクロサテライトをコードする遺伝子の変異を引き起こします。 BAT 25、BAT26、CAT25、トランスフォーミング成長因子受容体 II (TGF-RII)、および BAX [6]。

MSI はゲノム全体の不安定性 (MMR システムの欠陥に起因する) を反映しており、HIV 関連の子宮頸部上皮内腫瘍および肺腫瘍で発生頻度が高くなります。 どちらの場合も、MSI の頻度は、HIV 判定不能患者の腫瘍と比較して、HIV 関連腫瘍では 6 倍高かった[7]。 他の著者も、HIV 感染患者から得られたカポジ肉腫および悪性度の高いリンパ腫では MSI が高率に発生することを報告していますが、HIV 陰性患者の病変には同様の不安定性の証拠はありません [8]。 MSI 表現型が HIV 関連リンパ腫に限定されているという最近の観察は、遺伝的不安定性などの癌の主要な特徴が宿主免疫によって大きく影響される可能性があることを示唆しています [9]。

HIV 陽性患者における SCCA の MSI 状態は調査されたことがありませんが、我々は米国の 2 つの施設で SCCA と診断された HIV 患者 18 名と HIV+ 患者 10 名から採取した腫瘍標本の CIN 解析を実施しました [10]。 HIV 陰性患者の腫瘍は、HIV 陽性患者の腫瘍よりも CIN を呈する可能性が高かった (24.1% 対 6.6%、P<0.001)。 HIV 陰性の SCCA 患者では、染色体 17p、18q、5q、および 11q 上のヘテロ接合性の一貫した欠失 (LOH) が観察されました。 対照的に、HIV 陽性者の腫瘍には 17p、5q、および 18q での対立遺伝子欠損はほとんど存在せず、免疫抑制が CIN への代替経路を介して SCCA 進行を促進することを示しています。

現場での独自の研究:

申請者は結腸直腸外科医で、2001 年以来肛門直腸悪性腫瘍患者の治療に直接携わっています。 彼は、HIV 関連 SCCA における分子異常の特定のパターンを示す予備データを収集しました。 これらの発見は査読付き雑誌に掲載されており、その結果、申請者は編集者から定期的にその分野の専門家の意見や最先端の​​レビューを書くよう求められます。

スイスの HIV 陽性患者コホートは、既存のデータベースにすでに登録されている多数の個人と、ヒルシェル教授と彼のチームによって開発されたこの分野の既存の専門知識のため、この研究を実施するユニークな機会を提供します。 これらの腫瘍は比較的稀であるため、患者数が多いことは実際、このプロジェクトを開始するための絶対条件ではありません。

最後に重要なことですが、この研究の分子的側面は、我が国における遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌 (HNPCC) 検出の第一人者であるピエール ヒュッター博士の研究室で実施されます。 したがって、ヒッター博士の研究室は、ここに記載されている分子分析を実行するための優れた環境を提供します。

研究仮説:

我々は、HIV 集団においては、染色体不安定性ではなく、マイクロサテライト不安定性が、浸潤性 SCCA への肛門上皮内腫瘍の急速な進行の優先経路であると仮説を立てています。 2 番目の仮説は、これに比べて、HIV 陰性者の SCCA には MSI が存在しないか、少なくとも非常にまれであるというものです。

研究の目的と目的

この研究の主な目的は、スイスのコホートからSCCAと診断された15人のHIV陽性患者の腫瘍標本におけるマイクロサテライトの不安定性状態を評価することである。その後、HIV 陽性患者の SCCA における MSI の発生率を決定するために中間解析が実行されます。 この集団において腫瘍の大部分が MSI を示した場合、研究の第 2 部に進みます。その目的は、15 人の HIV 陰性患者の同様の腫瘍で同じ分析を実行し、SCCA の分子プロファイルを比較することです。両方の人口。 そうすることで、発がん進行における免疫抑制の潜在的な役割が確立される可能性があります。

研究のデザインと計画

忍耐：

生検により肛門扁平上皮癌と診断されたスイスのHIVコホートの患者は、既存のデータベースを使用して特定される。 可用性に応じて、3 つの SHCS センター間で少なくとも 15 個のサンプルを分析することを選択します。 SCCAの手術を受けたHIV陰性患者の腫瘍は、地元の倫理委員会によるプロトコールの審査を待って、ジュネーブ大学病院病理学部から回収される予定である。

介入：

すべての腫瘍サンプルは、病理学者による診断の確認のために再評価されます。 患者ごとに、DNA 抽出とマイクロサテライト ターゲットでのポリメラーゼ連鎖反応のために、腫瘍組織と正常粘膜の両方を含むパラフィン ブロックが選択されます。 組織は定期的に手術室から収集され、緩衝ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋され、分析用に選択されるまでのさまざまな月数保存されました。 パラフィン包埋ブロックをミクロトームで厚さ 20 µm の切片に切断します。 滅菌メスの刃を使用し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した切片をガイドとして利用して、解剖顕微鏡下で正常 (非腫瘍) 組織および癌組織の領域を顕微解剖します。 標本はトルオール中で脱パラフィンされ、無水エタノールで精製され、14,000 rpm で遠心分離されます。 ヒッター博士の研究室でのこれまでの経験により、パラフィン包埋腫瘍標本でこの種の分子分析を実行することが実際に技術的に可能であることが実証されました。

結腸直腸癌標本に推奨されるマイクロサテライト プライマーの参照パネルを使用して、SCCA におけるマイクロサテライト不安定性の存在を確認します。 これらには、マイクロサテライト マーカー BAT25、BAT26、および CAT25 が含まれます。

研究の評価:

データの初期評価は、最初の 15 個の腫瘍標本の分析後に実行されます。 HIV 陽性集団で MSI が検出された場合は、HIV 陰性患者の腫瘍でさらなる調査が行われます。 データ分析は、定期的にすべての研究者とともに実施される進捗報告の対象となります。 少なくとも当初は、次の 3 つの理由から分析を 15 個の腫瘍に限定することにしました。

1. これは比較的まれながんであり、スイスの HIV コホートから 25 人を超える SCCA 患者を回収できる可能性は低いです。
2. 私たちの以前の研究は、各グループの 18 個の腫瘍標本を使用して実施されましたが、グループ間の差異は統計的に有意でした。
3. これは予備的な探索的研究であり、作業仮説が間違っていることが判明する可能性があります。したがって、研究予算とヒッター博士の専門知識の利用可能性に応じて初期費用を制限することが重要です。 私たちの仮説が最初の結果によって裏付けられている場合、十分な資金源を使って追加の調査とより精緻な研究プロジェクトを進める可能性があります。 これらの理由から、私たちは研究を 3 つの SHCS センターに限定します。 チューリッヒ、ジュネーブ、ローザンヌは基本的に内臓外科部門間の既存の関係に基づいて選ばれました。

データ分析：

腫瘍の MSI 状態は Pierre Hutter によって評価されます。 この結果は、スイスのコホートからの疫学データと関連付けられ、ウイルス量、CD4+ 数、臨床転帰などの患者の臨床特性と関連付けられます。 その結果は、治療成績やがんの生存率とも相関します。

時間枠：

腫瘍標本は、2009 年の初めにローザンヌ、ジュネーブ、チューリッヒの病理学部門から回収される予定です。 MSI 分析は簡単な手順で、ヒッター博士の研究室では約 24 時間かかります。 したがって、HIV 陽性集団の 15 検体の分析は 2009 年 3 月末までに完了する予定です。 HIV 陰性集団におけるその後の分析に関するさらなる決定は、これらの最初の腫瘍で得られた結果に従って決定されます。

倫理的承認のステータス:

スイスの HIV コホート研究に登録された患者は、最初にこの種の研究に参加することに同意しました。 HIV センターのほぼすべての患者は、病気の経過に違いをもたらす可能性のある特定の要因を特定するために遺伝子研究に参加することに同意しました。 当然のことながら、すべての分析は腫瘍標本に対して行われ、患者の身元を追跡することはできません。 したがって、すべての遺伝子検査は完全に匿名になります。 対照的に、HIV陰性患者の腫瘍標本を対象に分析を行う場合は、ジュネーブの地元倫理委員会によるさらなる承認が求められることになる。

研究予算:

15 人の HIV 陽性患者の最初の分析は、ピエール ヒュッターによって無料で行われます。 分子研究の費用は 1 件あたり 250.-CHF と見積もられます。 したがって、このグループの MSI の分析が有望な結果につながる場合、12 ～ 15 人の HIV 陰性患者の分析費用は約 3,000 スイスフランかかると推定されます。 この種の研究に対する資金は、ジュネーブ大学病院外科の財団を通じて提供されます。