Anaalisyövän molekyylibiologia HIV-positiivisilla potilailla

Tausta:

Erittäin aktiivisen antiretroviraalisen hoidon (HAART) aikakaudella monien syöpien ilmaantuvuus on edelleen korkeampi HIV-positiivisilla kuin muulla väestöllä. Tämä ei päde vain AIDSin määrittäviin pahanlaatuisiin kasvaimiin, kuten Kaposin sarkoomaan tai lymfoomaan, vaan myös muihin syöpiin, jotka muodostavat 58 % kaikista kasvaimista äskettäin kuvatussa Yhdysvaltain kohortissa [1]. Tämä suuntaus on herättänyt uutta kiinnostusta karsinogeneesin molekulaaristen mekanismien ymmärtämiseen immuunivajautuneella potilaalla. Mahdollisia selityksiä ovat HAART-hoitoa saaneiden HIV-potilaiden pitkittynyt eloonjääminen, suuri onkogeenisten virusten samanaikainen infektio ja altistuminen riskeille, kuten tupakointi ja alkoholi [2].

Peräaukon okasolusyöpä (SCCA) edellyttää ihmisen papilloomaviruksen (HPV) DNA:n integroimista peräaukon solujen kromosomeihin. HIV-positiivisilla miehillä on lisääntynyt riski sairastua peräaukon syöpään. Sveitsiläinen tutkimus, joka yhdistää Sveitsin HIV-kohorttitutkimuksen ja Sveitsin kantonien syöpärekisterit, on osoittanut huomattavasti kohonneita peräaukon syövän SIR-arvoja (SIR = 33,4, 95 % CI = 10,5-78,6) [3]. On selvää, että HPV-HIV-yhteisinfektiolla on tärkeä rooli SCCA:n kehittymisessä, mutta liittyykö tämä panos karsinogeneesin erilliseen molekyylireittiin, jää hypoteettiseksi [4].

Peräaukon syöpä esiintyy aikaisemmin HIV-positiivisilla henkilöillä (keski-ikä 37 vuotta) verrattuna HIV-negatiivisiin miehiin (58 vuotta) ja HIV-negatiivisiin naisiin (65 vuotta). Tämä kahden vuosikymmenen ero puhkeamisiässä tukee hypoteesia, että SCCA:n biologia eroaa HIV-positiivisten ja HIV-negatiivisten potilaiden välillä [5]. HIV-infektion vaikutusta peräaukon HPV-infektion luontaiseen historiaan ymmärretään huonosti, mutta useimmat asiantuntijat ovat samaa mieltä kahdesta asiasta: 1) 95 % HIV-positiivisista homoseksuaalisista miehistä on saanut samanaikaisesti HPV-tartunnan; ja 2) HIV-infektio suosii HPV-infektion pysymistä sukupuolielinten sisällä (kohdunkaula, emätin ja peräaukko).

Syövän etenemiseen liittyy kaksi pääasiallista ja toisensa poissulkevaa genomisen epävakauden tyyppiä. Ensimmäinen, joka tunnetaan nimellä kromosomin epävakaus (CIN), johtuu useista geneettisistä muutoksista, mukaan lukien onkogeenien aktivaatio ja kasvainsuppressorigeenien, kuten p53 ja APC, inaktivaatio. Toinen, joka tunnetaan nimellä mikrosatelliittien epävakaus (MSI), johtuu DNA-virheen korjausgeenien (MMR), kuten MLH1:n, somaattisesta (hankitusta) inaktivaatiosta (sen promoottorin hypermetylaatiolla), mikä tyypillisesti johtaa geenien mutaatioon koodaavilla mikrosatelliiteilla, kuten esim. BAT 25, BAT26 ja CAT25, transformoiva kasvutekijäreseptori II (TGF-RII) ja BAX [6].

MSI heijastaa genominlaajuista epävakautta (johtuen puutteellisesta MMR-järjestelmästä), ja sitä esiintyy useammin HIV:hen liittyvässä kohdunkaulan intraepiteliaalisessa ja keuhkojen neoplasiassa. Molemmissa tapauksissa MSI:n esiintymistiheys oli kuusi kertaa suurempi HIV:hen liittyvissä kasvaimissa verrattuna HIV-potilaiden kasvaimiin [7]. Muut kirjoittajat ovat myös raportoineet korkeasta MSI:stä Kaposin sarkoomeissa ja aggressiivisissa lymfoomissa, jotka on saatu HIV-tartunnan saaneilta potilailta, kun taas ei ole näyttöä vastaavasta epävakaudesta HIV-negatiivisten potilaiden leesioissa [8]. Äskettäinen havainto, jonka mukaan MSI-fenotyyppi rajoittuu HIV:hen liittyviin lymfoomiin, viittaa siihen, että isännän immuniteetti voi vaikuttaa suuresti syövän pääpiirteeseen, kuten geneettiseen epävakauteen [9].

SCCA:n MSI-statusta HIV-positiivisilla potilailla ei ole koskaan tutkittu, mutta olemme suorittaneet CIN-analyysin kasvainnäytteistä 18 HIV- ja 10 HIV+-potilaalta, joilla on diagnosoitu SCCA kahdessa yhdysvaltalaisessa laitoksessa [10]. HIV-negatiivisten potilaiden kasvaimilla oli todennäköisemmin CIN:ää kuin HIV-positiivisten potilaiden kasvaimissa (24,1 % vs. 6,6 %, P<0,001). Jatkuva heterotsygoottisuuden (LOH) menetys kromosomeissa 17p, 18q, 5q ja 11q havaittiin HIV-negatiivisilla potilailla, joilla oli SCCA. Sitä vastoin alleelihäviö kohdissa 17p, 5q ja 18q puuttui käytännössä HIV-positiivisten yksilöiden kasvaimista, mikä osoittaa, että immuunisuppressio edistää SCCA:n etenemistä vaihtoehtoisen reitin kautta CIN:hen.

Alan oma tutkimus:

Hakija on kolorektaalikirurgi, joka on suoraan osallistunut anorektaalisten pahanlaatuisten kasvainten hoitoon vuodesta 2001 lähtien. Hän on kerännyt alustavia tietoja, jotka osoittavat erityisiä molekyylipoikkeavuuksia HIV:hen liittyvässä SCCA:ssa. Nämä havainnot on julkaistu vertaisarvioiduissa aikakauslehdissä, minkä seurauksena toimittajat pyytävät hakijaa säännöllisesti kirjoittamaan asiantuntijalausuntoja ja alan uusimpia arvioita.

Sveitsiläinen HIV-positiivisten potilaiden ryhmä tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden suorittaa tämä tutkimus, koska olemassa olevaan tietokantaan on jo ilmoittautunut suuri määrä henkilöitä ja professori Hirschelin ja hänen tiiminsä kehittämä alan asiantuntemus. Suuri potilaspopulaatio on todellakin ehdoton ehto tämän projektin aloittamiselle näiden kasvainten suhteellisen harvinaisuuden vuoksi.

Viimeisenä, mutta ei vähäisimpänä, tämän tutkimuksen molekyylinäkökohta suoritetaan tohtori Pierre Hutterin laboratoriossa, joka on maamme johtava perinnöllisen ei-polypoosisen paksusuolensyövän (HNPCC) havaitsemisessa. Siten Dr Hutter -laboratorio tarjoaa erinomaisen ympäristön tässä kuvattujen molekyylianalyysien suorittamiseen.

Tutkimushypoteesit:

Oletamme, että HIV-populaatiossa mikrosatelliittien epävakaus kromosomaalisen epävakauden sijaan on suositeltu tapa peräaukon intraepiteelin neoplasian nopealle etenemiselle kohti invasiivista SCCA:ta. Toinen hypoteesi on, että MSI:tä joko puuttuu tai se on ainakin erittäin harvinainen HIV-negatiivisten yksilöiden SCCA:ssa.

Opintojen tavoitteet ja tavoitteet

Tämän tutkimuksen ensisijaisena tavoitteena on arvioida mikrosatelliittien epävakauden tilaa kasvainnäytteissä 15 HIV-positiivisesta potilaasta Sveitsin kohortista, joilla oli diagnosoitu SCCA; sitten suoritetaan välianalyysi MSI:n esiintyvyyden määrittämiseksi HIV-positiivisten potilaiden SCCA:ssa. Jos suurimmalla osalla tämän populaation kasvaimista esiintyy MSI:tä, jatkamme tutkimuksen toiseen osaan, jonka tavoitteena on suorittaa samat analyysit samanlaisissa kasvaimissa 15 HIV-negatiivisella potilaalla ja siten verrata SCCA:n molekyyliprofiileja molemmat populaatiot. Näin tehden immuunisuppression mahdollinen rooli karsinogeneesin etenemisessä voidaan vahvistaa.

Tutkimuksen suunnittelu ja suunnitelma

Potilaat:

Potilaat sveitsiläisestä HIV-kohortista, joilla on biopsialla todistettu peräaukon levyepiteelisyöpä, tunnistetaan olemassa olevan tietokannan avulla. Päätämme analysoida vähintään 15 näytettä saatavuudesta riippuen kolmen SHCS-keskuksen välillä. HIV-negatiivisten potilaiden kasvaimet, joille tehtiin SCCA-leikkaus, noudetaan Geneven yliopistollisen sairaalan patologian osastolta, kunnes paikallinen eettinen toimikunta tarkistaa protokollan.

Interventio:

Patologi arvioi kaikki kasvainnäytteet uudelleen diagnoosin vahvistamiseksi. Kullekin potilaalle valitaan parafiinilohkoja, joissa on sekä kasvainkudosta että normaalia limakalvoa DNA-uuttoa ja polymeraasiketjureaktiota varten mikrosatelliittikohteissa. Kudokset kerättiin rutiininomaisesti leikkaussalista, kiinnitettiin puskuroituun formaliiniin, upotettiin parafiiniin ja säilytettiin vaihteleva määrä kuukausia ennen valintaa analyysiä varten. Parafiiniin upotetut lohkot leikataan mikrotomilla 20 µm paksuisiksi paloiksi. Steriilillä skalpellin terällä normaalin (ei-kasvain) ja syöpäkudoksen alueet leikataan mikrodissektointimikroskoopilla käyttäen hematoksyliini- ja eosiinivärjättyä leikettä oppaana. Näytteistä poistetaan parafiini toluolissa, puhdistetaan absoluuttisella etanolilla ja sentrifugoidaan nopeudella 14 000 rpm. Aikaisempi kokemus tohtori Hutterin laboratoriosta on osoittanut, että on todellakin teknisesti mahdollista suorittaa tämän tyyppinen molekyylianalyysi parafiiniin upotetussa kasvainnäytteessä.

Käytämme kolorektaalisyöpänäytteille suositeltua mikrosatelliittialukkeiden vertailupaneelia mikrosatelliitin epävakauden määrittämiseksi SCCA:ssa. Näitä ovat mikrosatelliittimerkit BAT25, BAT26 ja CAT25.

Tutkimusarviot:

Tietojen alustava arviointi suoritetaan 15 ensimmäisen kasvainnäytteen analyysin jälkeen. Jos MSI havaitaan HIV-positiivisessa populaatiossa, HIV-negatiivisten potilaiden kasvaimissa tehdään lisätutkimuksia. Tietojen analysoinnista laaditaan edistymisraportit, jotka laaditaan kaikkien tutkijoiden kanssa säännöllisin väliajoin. Päätimme rajoittaa analyysimme ainakin aluksi 15 kasvaimeen kolmesta syystä:

1. Tämä on suhteellisen harvinainen syöpä, ja on epätodennäköistä, että pystymme hakemaan yli 25 SCCA-potilasta Sveitsin HIV-kohortista.
2. Edellinen tutkimuksemme suoritettiin 18 kasvainnäytteellä kussakin ryhmässä, ja ryhmien väliset erot olivat tilastollisesti merkitseviä.
3. Tämä on pilottitutkimus, ja työhypoteesi voi osoittautua vääräksi; siksi on ratkaisevan tärkeää rajoittaa alkukustannuksia tutkimusbudjetin ja tohtori Hutterin asiantuntemuksen mukaisesti. Jos alustavat tulokset tukevat hypoteesiamme, voimme edetä lisätutkimuksilla ja pitkälle kehitetyllä tutkimusprojektilla riittävin rahoitusresurssein.¨ Näistä syistä rajoitamme tutkimuksemme kolmeen SHCS-keskukseen. Zürich, Geneve ja Lausanne valittiin pääasiassa sisäelinten kirurgian yksiköiden välisten olemassa olevien suhteiden perusteella.

Tietojen analysointi:

Pierre Hutter arvioi kasvainten MSI-tilan. Tulokset korreloidaan sitten sveitsiläisen kohortin epidemiologisten tietojen kanssa ja potilaiden kliinisten ominaisuuksien kanssa, mukaan lukien viruskuorma, CD4+ -määrä sekä kliiniset tulokset. Tulokset korreloivat myös hoidon tuloksen ja syövän eloonjäämisen kanssa.

Aikaikkuna:

Kasvainnäyte otetaan Lausannen, Geneven ja Zürichin patologian osastoilta vuoden 2009 alussa. MSI-analyysi on yksinkertainen toimenpide, joka kestää noin 24 tuntia tohtori Hutterin laboratoriossa. Siten HIV-positiivisen väestön 15 näytteen analyysi valmistuu maaliskuun 2009 loppuun mennessä. Lisäpäätökset HIV-negatiivisen populaation myöhempiä analyyseja koskevista päätöksistä tehdään sitten näissä alkuperäisissä kasvaimissa saatujen tulosten mukaan.

Eettisen hyväksynnän tila:

Sveitsin HIV-kohorttitutkimukseen otetut potilaat antoivat aluksi suostumuksensa osallistua tämäntyyppiseen tutkimukseen. Lähes kaikki HIV-keskusten potilaat suostuivat osallistumaan geneettiseen tutkimukseen, jotta löydettäisiin erityisiä tekijöitä, jotka voivat aiheuttaa eroja taudin kulussa. Ilmeisesti kaikki analyysit tehdään kasvainnäytteelle, eikä niitä voida jäljittää potilaiden henkilöllisyyksiin. Siten kaikki geneettiset testaukset ovat täysin anonyymejä. Sitä vastoin Geneven paikalliselta eettiseltä komitealta haetaan lisähyväksyntä, jos analyysi tehdään HIV-negatiivisten potilaiden kasvainnäytteestä.

Opintobudjetti:

Pierre Hutter suorittaa 15 HIV-positiivisen potilaan alustavan analyysin ilmaiseksi. Molekyylitutkimuksen kustannukset on arvioitu 250.-CHF tapausta kohti. Siten siinä tapauksessa, että MSI-analyysi tässä ryhmässä johtaa lupaaviin tuloksiin, on arvioitu, että analyysikustannukset 12-15 HIV-negatiivisella potilaalla maksavat noin 3 000.-CHF. Rahoitusta tämäntyyppiseen tutkimukseen on saatavilla Geneven yliopistollisen sairaalan kirurgian laitoksen Fonds de Servicen kautta.