Molekularbiologie von Analkrebs bei HIV-positiven Patienten

Hintergrund:

Im Zeitalter der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) ist die Inzidenz vieler Krebserkrankungen bei HIV-Positiven weiterhin höher als in der Allgemeinbevölkerung. Dies gilt nicht nur für AIDS-definierende Malignome wie das Kaposi-Sarkom oder das Kaposi-Lymphom, sondern auch für andere Krebsarten, die in einer kürzlich beschriebenen US-Kohorte 58 % aller Neoplasien ausmachen [1]. Dieser Trend hat ein erneutes Interesse am Verständnis der molekularen Mechanismen der Karzinogenese bei immunsupprimierten Patienten geweckt. Zu den möglichen Erklärungen gehören ein längeres Überleben von Patienten mit HIV unter HAART, eine hohe Inzidenz einer Koinfektion mit onkogenen Viren und die Exposition gegenüber Risiken wie Rauchen und Alkohol [2].

Das Plattenepithelkarzinom des Anus (SCCA) erfordert die Integration der DNA des humanen Papillomavirus (HPV) in die Chromosomen der Analkanalzellen. HIV-positive Männer haben ein erhöhtes Risiko, an Analkrebs zu erkranken. Eine Schweizer Studie, die die Schweizer HIV-Kohortenstudie und kantonale Krebsregister in der Schweiz verknüpft, hat stark erhöhte SIRs für Analkrebs gezeigt (SIR = 33,4, 95 %-KI = 10,5–78,6) [3]. Offensichtlich spielt die HPV-HIV-Koinfektion eine wichtige Rolle bei der SCCA-Entwicklung. Ob dieser Beitrag jedoch mit einem bestimmten molekularen Weg der Karzinogenese zusammenhängt, bleibt hypothetisch [4].

Analkrebs tritt bei HIV-positiven Personen (Durchschnittsalter 37 Jahre) früher auf als bei HIV-negativen Männern (58 Jahre) und HIV-negativen Frauen (65 Jahre). Dieser Unterschied von zwei Jahrzehnten im Erkrankungsalter stützt die Hypothese, dass sich die Biologie von SCCA zwischen HIV-positiven und HIV-negativen Patienten unterscheidet [5]. Die Auswirkung einer HIV-Infektion auf den natürlichen Verlauf einer analen HPV-Infektion ist kaum bekannt, aber die meisten Experten sind sich in zwei Punkten einig: 1) 95 % der HIV-positiven homosexuellen Männer sind mit HPV koinfiziert; und 2) Eine HIV-Infektion begünstigt das Fortbestehen einer HPV-Infektion im Anogenitaltrakt (Gebärmutterhals, Vagina und Analkanal).

Am Fortschreiten des Krebses sind zwei wichtige und sich gegenseitig ausschließende Arten genomischer Instabilität beteiligt. Die erste, sogenannte chromosomale Instabilität (CIN), resultiert aus einer Reihe genetischer Veränderungen, einschließlich der Aktivierung von Onkogenen und der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen wie p53 und APC. Die zweite, als Mikrosatelliteninstabilität (MSI) bekannte, resultiert aus der somatischen (erworbenen) Inaktivierung von DNA-Mismatch-Reparaturgenen (MMR) wie MLH1 (durch Hypermethylierung seines Promotors), was typischerweise zu einer Mutation von Genen mit kodierenden Mikrosatelliten führt, wie z BAT 25, BAT26 und CAT25, transformierender Wachstumsfaktor-Rezeptor II (TGF-RII) und BAX [6].

MSI spiegelt eine genomweite Instabilität wider (aufgrund eines mangelhaften MMR-Systems) und tritt häufiger bei HIV-assoziierten zervikalen intraepithelialen Neoplasien und Lungenneoplasien auf. In beiden Fällen war die Häufigkeit von MSI bei HIV-assoziierten Tumoren sechsmal höher als bei Tumoren von HIV-indeterminierten Patienten [7]. Andere Autoren haben ebenfalls über eine hohe MSI-Rate bei Kaposi-Sarkomen und aggressiven Lymphomen von HIV-infizierten Patienten berichtet, wohingegen es keine Hinweise auf eine ähnliche Instabilität bei Läsionen von HIV-negativen Patienten gibt [8]. Die jüngste Beobachtung, dass der MSI-Phänotyp auf HIV-assoziierte Lymphome beschränkt ist, legt nahe, dass ein zentrales Merkmal von Krebs, wie etwa die genetische Instabilität, stark durch die Immunität des Wirts beeinflusst werden kann [9].

Der MSI-Status von SCCA bei HIV-positiven Patienten wurde nie untersucht, wir haben jedoch eine CIN-Analyse von Tumorproben von 18 HIV- und 10 HIV+-Patienten durchgeführt, bei denen SCCA in zwei US-Einrichtungen diagnostiziert wurde [10]. Bei Tumoren bei HIV-negativen Patienten war die Wahrscheinlichkeit einer CIN höher als bei Tumoren bei HIV-positiven Patienten (24,1 % gegenüber 6,6 %, P < 0,001). Bei HIV-negativen Patienten mit SCCA wurde ein anhaltender Verlust der Heterozygotie (LOH) auf den Chromosomen 17p, 18q, 5q und 11q beobachtet. Im Gegensatz dazu kam es bei Tumoren von HIV-positiven Personen praktisch nicht zu einem Allelverlust bei 17p, 5q und 18q, was darauf hindeutet, dass die Immunsuppression das Fortschreiten von SCCA über einen alternativen Weg zu CIN fördert.

Eigene Forschung auf dem Gebiet:

Der Antragsteller ist ein kolorektaler Chirurg, der seit 2001 direkt an der Behandlung von Patienten mit anorektalen Malignomen beteiligt ist. Er hat vorläufige Daten gesammelt, die spezifische Muster molekularer Aberrationen bei HIV-bedingtem SCCA zeigen. Diese Ergebnisse wurden in von Experten begutachteten Fachzeitschriften veröffentlicht, was zur Folge hat, dass der Antragsteller regelmäßig von den Herausgebern gebeten wird, Expertenmeinungen und aktuelle Rezensionen auf diesem Gebiet zu verfassen.

Die Schweizer Kohorte HIV-positiver Patienten wird aufgrund der großen Anzahl von Personen, die bereits in die bestehende Datenbank aufgenommen wurden, und der vorhandenen Fachkompetenz, die Professor Hirschel und sein Team auf diesem Gebiet entwickelt haben, eine einzigartige Gelegenheit zur Durchführung dieser Forschung bieten. Aufgrund der relativen Seltenheit dieser Tumoren ist eine große Patientenpopulation tatsächlich eine unabdingbare Voraussetzung für den Start dieses Projekts.

Nicht zuletzt wird der molekulare Aspekt dieser Forschung im Labor von Dr. Pierre Hutter, PhD, durchgeführt, der in unserem Land führend in der Erkennung von erblichem nicht-polyposisem Darmkrebs (HNPCC) ist. Somit bietet das Labor von Dr. Hutter eine hervorragende Umgebung für die Durchführung der hier beschriebenen molekularen Analysen.

Studienhypothesen:

Wir gehen davon aus, dass in der HIV-Population die Mikrosatelliteninstabilität und nicht die chromosomale Instabilität der bevorzugte Weg für das schnelle Fortschreiten der analen intraepithelialen Neoplasie hin zur invasiven SCCA ist. Die zweite Hypothese besagt, dass im Vergleich dazu MSI bei SCCA von HIV-negativen Personen entweder fehlt oder zumindest sehr selten vorkommt.

Studienziele und -ziele

Das Hauptziel dieser Studie ist die Beurteilung des Mikrosatelliteninstabilitätsstatus in Tumorproben von 15 HIV-positiven Patienten aus der Schweizer Kohorte, bei denen SCCA diagnostiziert wurde; Anschließend wird eine Zwischenanalyse durchgeführt, um die Inzidenz von MSI bei SCCA bei HIV-positiven Patienten zu bestimmen. Wenn die Mehrheit der Tumoren in dieser Population MSI aufweist, werden wir mit dem zweiten Teil der Studie fortfahren, dessen Ziel darin besteht, die gleichen Analysen in ähnlichen Tumoren von 15 HIV-negativen Patienten durchzuführen und so die molekularen Profile von SCCA zu vergleichen beide Populationen. Auf diese Weise könnte die mögliche Rolle der Immunsuppression beim Fortschreiten der Karzinogenese ermittelt werden.

Studiendesign und -plan

Patienten:

Patienten aus der Schweizer HIV-Kohorte mit einer bioptisch gesicherten Diagnose eines Plattenepithelkarzinoms des Anus werden anhand der bestehenden Datenbank identifiziert. Wir entscheiden uns dafür, je nach Verfügbarkeit mindestens 15 Proben in drei SHCS-Zentren zu analysieren. Tumore von HIV-negativen Patienten, die sich einer SCCA-Operation unterzogen haben, werden aus der Abteilung für Pathologie des Universitätsspitals Genf abgeholt, bis das Protokoll von der örtlichen Ethikkommission überprüft wird.

Intervention:

Alle Tumorproben werden zur Bestätigung der Diagnose durch einen Pathologen erneut untersucht. Für jeden Patienten werden Paraffinblöcke mit Tumorgewebe und normaler Schleimhaut für die DNA-Extraktion und Polymerasekettenreaktion an Mikrosatellitenzielen ausgewählt. Die Gewebe wurden routinemäßig im Operationssaal entnommen, in gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und für eine variable Anzahl von Monaten gelagert, bevor sie für die Analyse ausgewählt wurden. In Paraffin eingebettete Blöcke werden mit einem Mikrotom in 20 µm dicke Abschnitte geschnitten. Mit einer sterilen Skalpellklinge werden Bereiche von normalem (nicht tumorösem) und Krebsgewebe unter einem Präpariermikroskop mikrodisseziert, wobei ein mit Hämatoxylin und Eosin gefärbter Schnitt als Orientierung dient. Die Proben werden in Toluol entparaffiniert, mit absolutem Ethanol gereinigt und bei 14.000 U/min zentrifugiert. Frühere Erfahrungen im Labor von Dr. Hutter haben gezeigt, dass es tatsächlich technisch möglich ist, diese Art der molekularen Analyse in Paraffin-eingebetteten Tumorproben durchzuführen.

Wir werden die für Darmkrebsproben empfohlene Referenzgruppe von Mikrosatellitenprimern verwenden, um das Vorhandensein einer Mikrosatelliteninstabilität bei SCCA zu bestimmen. Dazu gehören die Mikrosatellitenmarker BAT25, BAT26 sowie CAT25.

Studienauswertungen:

Die erste Auswertung der Daten erfolgt nach der Analyse der ersten 15 Tumorproben. Wenn MSI in der HIV-positiven Bevölkerung festgestellt wird, werden weitere Untersuchungen an Tumoren von HIV-negativen Patienten durchgeführt. Die Datenanalyse wird Gegenstand von Fortschrittsberichten sein, die in regelmäßigen Abständen mit allen Prüfärzten erstellt werden. Wir haben uns aus drei Gründen entschieden, unsere Analyse zumindest zunächst auf 15 Tumoren zu beschränken:

1. Dies ist eine relativ seltene Krebsart und es ist unwahrscheinlich, dass wir mehr als 25 SCCA-Patienten aus der Schweizer HIV-Kohorte gewinnen können.
2. Unsere vorherige Studie wurde mit 18 Tumorproben in jeder Gruppe durchgeführt und die Unterschiede zwischen den Gruppen waren statistisch signifikant.
3. Dies ist eine explorative Pilotstudie, und die Arbeitshypothese könnte sich als falsch erweisen. Daher ist es wichtig, die Anfangskosten entsprechend dem Studienbudget und der Verfügbarkeit von Dr. Hutters Fachwissen zu begrenzen. Wenn unsere Hypothese durch die ersten Ergebnisse gestützt wird, können wir mit zusätzlichen Untersuchungen und einem detaillierteren Forschungsprojekt mit angemessenen Finanzierungsressourcen fortfahren.¨ Aus diesen Gründen werden wir unsere Forschung auf drei SHCS-Zentren beschränken. Zürich, Genf und Lausanne wurden im Wesentlichen aufgrund der bestehenden Beziehungen zwischen den viszeralchirurgischen Einheiten ausgewählt.

Datenanalyse:

Der MSI-Status von Tumoren wird von Pierre Hutter beurteilt. Die Ergebnisse werden dann mit den epidemiologischen Daten der Schweizer Kohorte korreliert und mit den klinischen Merkmalen der Patienten, einschließlich Viruslast, CD4+-Zahl sowie dem klinischen Ergebnis, korreliert. Die Ergebnisse werden auch mit dem Behandlungsergebnis und dem Krebsüberleben korreliert.

Zeitfenster:

Anfang 2009 werden Tumorproben aus den Abteilungen für Pathologie in Lausanne, Genf und Zürich entnommen. Die MSI-Analyse ist ein unkompliziertes Verfahren, das im Labor von Dr. Hutter etwa 24 Stunden dauert. Somit wird die Analyse der 15 Proben der HIV-positiven Population bis Ende März 2009 abgeschlossen sein. Die weitere Entscheidung über nachfolgende Analysen in der HIV-negativen Bevölkerung wird dann auf der Grundlage der bei diesen ursprünglichen Tumoren erzielten Ergebnisse getroffen.

Status der ethischen Zulassung:

Die in die Schweizer HIV-Kohortenstudie aufgenommenen Patienten gaben zunächst ihr Einverständnis zur Teilnahme an dieser Art von Studie. Fast alle Patienten in den HIV-Zentren erklärten sich bereit, an der Genforschung teilzunehmen, um spezifische Faktoren zu identifizieren, die zu Unterschieden im Krankheitsverlauf führen könnten. Natürlich werden alle Analysen an Tumorproben durchgeführt und diese können nicht auf die Identität der Patienten zurückgeführt werden. Daher sind alle Gentests völlig anonym. Sollte die Analyse hingegen an Tumorproben von HIV-negativen Patienten durchgeführt werden, wird eine weitere Genehmigung der örtlichen Ethikkommission in Genf eingeholt.

Studienbudget:

Die Erstanalyse von 15 HIV-positiven Patienten wird von Pierre Hutter kostenlos durchgeführt. Die Kosten für eine molekulare Studie werden auf 250.-CHF pro Fall geschätzt. Sollte also die Analyse des MSI in dieser Gruppe zu vielversprechenden Ergebnissen führen, werden die Kosten für die Analyse bei 12–15 HIV-negativen Patienten schätzungsweise etwa 3.000,- CHF betragen. Die Finanzierung dieser Art von Forschung erfolgt über den Fonds de Service der Abteilung für Chirurgie des Universitätsspitals Genf.