Biologia molecolare del cancro anale nei pazienti sieropositivi

Sfondo:

Nell'era della terapia antiretrovirale altamente attiva (HAART), l'incidenza di molti tumori rimane più elevata nei sieropositivi rispetto alla popolazione generale. Questo non è vero solo per i tumori maligni che definiscono l'AIDS, come il sarcoma o il linfoma di Kaposi, ma anche per altri tumori, che comprendono il 58% di tutte le neoplasie in una coorte statunitense descritta di recente [1]. Questa tendenza ha generato un rinnovato interesse nella comprensione dei meccanismi molecolari della carcinogenesi nel paziente immunodepresso. Le possibili spiegazioni includono la sopravvivenza prolungata dei pazienti con HIV sottoposti a HAART, l'elevata incidenza di co-infezione con virus oncogeni e l'esposizione a rischi come il fumo e l'alcool [2].

Il carcinoma a cellule squamose dell'ano (SCCA) richiede l'integrazione del DNA del papillomavirus umano (HPV) nei cromosomi delle cellule del canale anale. Gli uomini sieropositivi corrono un rischio maggiore di sviluppare il cancro anale. Uno studio svizzero che collega lo studio svizzero di coorte HIV e i registri cantonali svizzeri dei tumori ha mostrato SIR molto elevati per il cancro anale (SIR = 33,4, IC 95% = 10,5-78,6) [3]. Chiaramente, la coinfezione da HPV-HIV svolge un ruolo importante nello sviluppo di SCCA, ma rimane ipotetico se questo contributo sia associato a un percorso molecolare distinto di carcinogenesi [4].

Il cancro anale si verifica prima negli individui sieropositivi (età media 37 anni) rispetto agli uomini sieronegativi (58 anni) e alle donne sieronegative (65 anni). Questa differenza di due decenni nell'età di insorgenza supporta l'ipotesi che la biologia della SCCA differisca tra pazienti HIV-positivi e HIV-negativi [5]. L'effetto dell'infezione da HIV sulla storia naturale dell'infezione anale da HPV è poco conosciuto, ma la maggior parte degli esperti concorda su due punti: 1) il 95% degli uomini omosessuali sieropositivi è co-infettato dall'HPV; e 2) l'infezione da HIV favorisce la persistenza dell'infezione da HPV all'interno del tratto ano-genitale (cervice uterino, vagina e canale anale).

Due tipi principali e mutuamente esclusivi di instabilità genomica sono coinvolti nella progressione del cancro. Il primo, noto come instabilità cromosomica (CIN), deriva da una serie di cambiamenti genetici, tra cui l'attivazione di oncogeni e l'inattivazione di geni soppressori del tumore come p53 e APC. La seconda, nota come instabilità dei microsatelliti (MSI), deriva dall'inattivazione somatica (acquisita) dei geni di riparazione del mismatch del DNA (MMR), come MLH1 (per ipermetilazione del suo promotore), che tipicamente porta alla mutazione di geni con microsatelliti codificanti, come BAT 25, BAT26 e CAT25, recettore del fattore di crescita trasformante II (TGF-RII) e BAX [6].

L'MSI riflette l'instabilità dell'intero genoma (derivante da un sistema MMR carente) e si verifica con maggiore frequenza nelle neoplasie cervicali intraepiteliali e polmonari associate all'HIV. In entrambi i casi, la frequenza di MSI era sei volte maggiore nei tumori associati all'HIV, rispetto ai tumori dei pazienti HIV-indeterminati [7]. Altri autori hanno anche riportato un alto tasso di MSI nei sarcomi di Kaposi e nei linfomi aggressivi ottenuti da pazienti con infezione da HIV, mentre non vi è evidenza di simile instabilità nelle lesioni da pazienti HIV-negativi [8]. La recente osservazione che il fenotipo MSI è limitato ai linfomi correlati all'HIV suggerisce che una caratteristica cardinale del cancro, come l'instabilità genetica, può essere fortemente influenzata dall'immunità dell'ospite [9].

Lo stato MSI di SCCA in pazienti HIV positivi non è mai stato studiato, ma abbiamo eseguito un'analisi CIN di campioni tumorali da 18 pazienti HIV- e 10 HIV+ con diagnosi di SCCA in due istituzioni statunitensi [10]. I tumori nei pazienti HIV-negativi avevano maggiori probabilità di presentare CIN rispetto ai tumori nei pazienti HIV-positivi (24,1% contro 6,6%, P<0,001). Perdita consistente di eterozigosi (LOH) sui cromosomi 17p, 18q, 5q e 11q è stata osservata in pazienti HIV-negativi con SCCA. Al contrario, la perdita allelica a 17p, 5q e 18q era praticamente assente nei tumori di individui HIV positivi, indicando che la soppressione immunitaria promuove la progressione SCCA attraverso un percorso alternativo verso la CIN.

Propria ricerca sul campo:

Il ricorrente è un chirurgo colorettale, direttamente coinvolto nel trattamento di pazienti con neoplasie anorettali dal 2001. Ha raccolto dati preliminari che mostrano modelli specifici di aberrazioni molecolari nella SCCA correlata all'HIV. Questi risultati sono stati pubblicati su riviste sottoposte a revisione paritaria, con la conseguenza che il richiedente è regolarmente sollecitato dagli editori a scrivere pareri di esperti e revisioni sullo stato dell'arte nel settore.

La coorte svizzera di pazienti sieropositivi offrirà un'opportunità unica per condurre questa ricerca, grazie al gran numero di individui già arruolati nel database esistente e all'esperienza esistente nel campo sviluppata dal professor Hirschel e dal suo team. Una vasta popolazione di pazienti è infatti una condizione sine qua none per avviare questo progetto a causa della relativa rarità di questi tumori.

Ultimo ma non meno importante, l'aspetto molecolare di questa ricerca sarà condotto nel laboratorio del dottor Pierre Hutter, PhD, che è leader nel nostro paese per la rilevazione del carcinoma colorettale ereditario non poliposico (HNPCC). Pertanto, il laboratorio del dottor Hutter fornirà un ambiente eccellente per eseguire le analisi molecolari qui descritte.

Ipotesi di studio:

Ipotizziamo che, nella popolazione HIV, l'instabilità dei microsatelliti, piuttosto che l'instabilità cromosomica, sia la via preferita per la rapida progressione della neoplasia intraepiteliale anale verso SCCA invasiva. La seconda ipotesi è che, in confronto, l'MSI sia assente o almeno molto raro nella SCCA di individui HIV-negativi.

Finalità e obiettivi dello studio

L'obiettivo principale di questo studio è valutare lo stato di instabilità dei microsatelliti nei campioni tumorali di 15 pazienti HIV positivi della coorte svizzera a cui è stata diagnosticata SCCA; verrà quindi eseguita un'analisi ad interim per determinare l'incidenza di MSI in SCCA di pazienti HIV positivi. Se la maggioranza dei tumori presenta MSI in questa popolazione, si procederà con la seconda parte dello studio, il cui obiettivo è quello di eseguire le stesse analisi in tumori simili di 15 pazienti HIV-negativi, e quindi confrontare i profili molecolari di SCCA in entrambe le popolazioni. In tal modo, potrebbe essere stabilito il ruolo potenziale dell'immunosoppressione nella progressione della carcinogenesi.

Progettazione e piano dello studio

Pazienti:

I pazienti della coorte HIV svizzera con una diagnosi di carcinoma a cellule squamose dell'ano confermata da biopsia saranno identificati utilizzando la banca dati esistente. Scegliamo di analizzare almeno 15 campioni, a seconda della disponibilità, tra 3 centri SHCS. I tumori di pazienti HIV-negativi sottoposti a intervento chirurgico per SCCA saranno recuperati dal Dipartimento di Patologia dell'Ospedale Universitario di Ginevra, in attesa della revisione del protocollo da parte del Comitato Etico locale.

Intervento:

Tutti i campioni di tumore saranno rivalutati per la conferma della diagnosi da un patologo. Per ogni paziente, verranno selezionati blocchi di paraffina sia con tessuto tumorale che con mucosa normale per l'estrazione del DNA e la reazione a catena della polimerasi a target microsatelliti. I tessuti venivano regolarmente raccolti dalla sala operatoria, fissati in formalina tamponata, inclusi in paraffina e conservati per un numero variabile di mesi prima della selezione per l'analisi. Blocchi inclusi in paraffina saranno tagliati con un microtomo in sezioni spesse 20 µm. Utilizzando una lama di bisturi sterile, le aree di tessuto normale (non tumorale) e canceroso saranno microdissezionate sotto un microscopio da dissezione utilizzando una sezione colorata con ematossilina ed eosina come guida. I campioni saranno deparaffinati in toluolo, purificati con etanolo assoluto e centrifugati a 14.000 rpm. La precedente esperienza nel laboratorio del dottor Hutter ha dimostrato che è davvero tecnicamente possibile eseguire questo tipo di analisi molecolare in campioni tumorali inclusi in paraffina.

Useremo il pannello di riferimento dei primer microsatelliti raccomandati per i campioni di cancro del colon-retto per determinare la presenza di instabilità dei microsatelliti nella SCCA. Questi includono i marcatori microsatelliti BAT25, BAT26 e CAT25.

Valutazioni dello studio:

La valutazione iniziale dei dati verrà eseguita dopo l'analisi dei primi 15 campioni di tumori. Se la MSI viene rilevata nella popolazione sieropositiva, ulteriori indagini saranno condotte nei tumori di pazienti HIV negativi. L'analisi dei dati sarà soggetta a relazioni sullo stato di avanzamento condotte con tutti gli investigatori a intervalli regolari. Abbiamo scelto di restringere, almeno inizialmente, la nostra analisi a 15 tumori per tre motivi:

1. Si tratta di un tumore relativamente raro ed è improbabile che saremo in grado di recuperare più di 25 pazienti SCCA dalla coorte svizzera di HIV.
2. Il nostro studio precedente è stato condotto con 18 campioni di tumori in ciascun gruppo e le differenze tra i gruppi erano statisticamente significative.
3. Questo è uno studio esplorativo pilota e l'ipotesi di lavoro potrebbe rivelarsi sbagliata; è quindi fondamentale limitare i costi iniziali in conformità con il budget dello studio e la disponibilità dell'esperienza del dott. Hutter. Se la nostra ipotesi è supportata dai risultati iniziali, potremmo procedere con ulteriori indagini e un progetto di ricerca più elaborato con adeguate risorse di finanziamento.¨ Per questi motivi, limiteremo la nostra ricerca a tre centri SHCS. Zurigo, Ginevra e Losanna sono state scelte essenzialmente sulla base dei rapporti esistenti tra le unità di chirurgia viscerale.

Analisi dei dati:

Lo stato MSI dei tumori sarà valutato da Pierre Hutter. I risultati saranno quindi correlati con i dati epidemiologici della coorte svizzera e correlati con le caratteristiche cliniche dei pazienti, inclusa la carica virale, la conta dei CD4+ e l'esito clinico. I risultati saranno anche correlati con l'esito del trattamento e la sopravvivenza al cancro.

Lasso di tempo:

All'inizio del 2009 i campioni di tumore saranno prelevati dai dipartimenti di patologia di Losanna, Ginevra e Zurigo. L'analisi MSI è una procedura semplice, che richiede circa 24 ore nel laboratorio del dottor Hutter. Pertanto, l'analisi dei 15 campioni nella popolazione sieropositiva sarà completata entro la fine di marzo 2009. L'ulteriore decisione in merito alle successive analisi nella popolazione HIV-negativa sarà poi sottoposta a decisione, in base ai risultati ottenuti in questi tumori iniziali.

Stato dell'approvazione etica:

I pazienti arruolati nello studio di coorte svizzero sull'HIV hanno inizialmente dato il loro consenso a partecipare a questo tipo di studio. Quasi tutti i pazienti dei centri HIV hanno acconsentito a partecipare alla ricerca genetica per identificare fattori specifici che potrebbero determinare differenze nel decorso della malattia. Ovviamente tutte le analisi verranno eseguite su campioni tumorali, e questi non saranno riconducibili all'identità dei pazienti. Pertanto, tutti i test genetici saranno totalmente anonimi. Al contrario, sarà richiesta un'ulteriore approvazione da parte del Comitato etico locale di Ginevra, nel caso in cui l'analisi venga eseguita su campioni tumorali di pazienti HIV-negativi.

Budget di studio:

L'analisi iniziale di 15 pazienti sieropositivi sarà eseguita gratuitamente da Pierre Hutter. Il costo per lo studio molecolare è stimato a 250.-CHF per caso. Pertanto, nel caso in cui l'analisi del MSI in questo gruppo porti a risultati promettenti, si stima che il costo dell'analisi in 12-15 pazienti HIV-negativi costerà circa 3.000 CHF. I finanziamenti per questo tipo di ricerca saranno disponibili attraverso il Fonds de Service del Dipartimento di Chirurgia dell'Ospedale Universitario di Ginevra.