Izolace a charakterizace extracelulárních vezikul vylučovaných lidským endometriem

V posledních desetiletích byla emise membránou uzavřených kompartmentů, běžněji považovaných za extracelulární vezikuly, stanovena jako nový mechanismus komunikace buď mezi buňkami komplexního organismu, mezi jednobuněčnými organismy nebo mezi jednobuněčným organismem a hostitelem. Tyto vezikuly byly popsány ve všech tělesných tekutinách a v současnosti jsou klasifikovány do tří typů podle mechanismu, kterým jsou tvořeny: exozomy o velikosti od 30 do 150 nm (tvořené intracelulárně); mikrovezikuly, mezi 100 a 1000 nm (vytvořené z buněčné membrány) a apoptotická tělíska o velikosti větší než 1 um (produkovaná buňkami podstupujícími programovanou buněčnou smrt).

Endometriální tekutina je viskózní tekutina přítomná v děložní dutině pocházející z různých typů buněk, které tvoří dělohu a sérové ​​exsudáty. Nabízí přesný pohled na kontext, ve kterém se embryo implantuje a může být získáno minimálně invazivní technikou.

Hlavním cílem této pilotní studie je izolovat a charakterizovat extracelulární vezikuly vylučované endometriem do endometriální tekutiny, což je poprvé, kdy je tato skutečnost popsána. Je zamýšleno standardizovat způsob izolace různých populací vezikul přítomných v endometriální tekutině (tj. apoptotická tělíska, mikrovezikuly a exozomy), založený na sériové diferenciální centrifugaci a filtraci. Morfologická charakterizace izolovaných vezikul bude provedena na třech úrovních: studium vnější morfologie pomocí transmisní elektronové mikroskopie, charakterizace povrchových markerů různých populací vezikul pomocí Western Blot a analýza distribuce velikosti populací vezikul pomocí analýzy sledování nanočástic.

Druhá část studie je zaměřena na hodnocení obsahu extracelulárních vezikul v průběhu menstruačního cyklu. Pro tento účel byl kanonický menstruační cyklus v délce 28 až 30 dnů rozdělen do 5 fází: fáze I (dny 0-8), fáze II (9.-14. den), fáze III (15.-18. den), fáze IV ( dny 19-24) a fáze V (25 až 30). Experimentální návrh pro popis obsahu váčků sestává ze dvou úrovní srovnání: (1) analýza rozdílného obsahu různých populací vezikul ve stejné fázi menstruačního cyklu a pro každou z fází a (2) analýza rozdílného obsahu váčků. stejnou populaci vezikul v každé fázi cyklu a pro každou z vezikulárních populací. Tato charakterizace vezikulárního obsahu bude provedena pomocí technik hmotnostní spektrometrie pro analýzu složení proteinů, lipidů a dalších malých metabolitů. Jejich přítomnost má souviset jak s okamžikem cyklu, tak s normální fyziologickou funkcí endometria. Na druhé straně bude provedena analýza obsahu DNA a RNA těchto vezikulárních populací pomocí masivního sekvenování. Cílem je zde analyzovat přenos funkcí do cílových buněk a také potenciální prediktivní užitečnost těchto molekul pro určení okamžiku menstruačního cyklu.