Aislamiento y Caracterización de las Vesículas Extracelulares Secretadas por el Endometrio Humano

En las últimas décadas, la emisión de compartimentos encerrados en membranas, más comúnmente considerados como vesículas extracelulares, se ha establecido como un nuevo mecanismo de comunicación ya sea entre células de un organismo complejo, entre organismos unicelulares o entre organismo unicelular y huésped. Estas vesículas se han descrito en todos los fluidos corporales y actualmente se clasifican en tres tipos según el mecanismo por el cual se forman: exosomas, con tamaños que van de 30 a 150 nm (formados intracelularmente); microvesículas, entre 100 y 1000 nm (formadas a partir de la membrana celular) y cuerpos apoptóticos, con tamaños superiores a 1 µm (producidos por células en muerte celular programada).

El líquido endometrial es un líquido viscoso presente en la cavidad uterina procedente de los diferentes tipos de células que forman el útero y exudados séricos. Ofrece una visión precisa del contexto en el que se implanta el embrión y puede recuperarse mediante una técnica mínimamente invasiva.

El principal objetivo de este estudio piloto es aislar y caracterizar las vesículas extracelulares secretadas por el endometrio al líquido endometrial, siendo esta la primera vez que se describe este hecho. Se pretende estandarizar un método para el aislamiento de las diferentes poblaciones de vesículas presentes en el líquido endometrial (es decir: cuerpos apoptóticos, microvesículas y exosomas), basado en centrifugaciones diferenciales en serie y filtración. La caracterización morfológica de las vesículas aisladas se realizará a tres niveles: estudio de la morfología externa mediante microscopía electrónica de transmisión, caracterización de los marcadores de superficie de las diferentes poblaciones de vesículas mediante Western Blot y análisis de las distribuciones de tamaño de las poblaciones de vesículas mediante Nanoparticle Tracking Analysis.

La segunda parte del estudio está dirigida a evaluar el contenido de las vesículas extracelulares a lo largo del ciclo menstrual. Para ello, se ha clasificado un ciclo menstrual canónico de 28 a 30 días en 5 fases: fase I (días 0-8), fase II (días 9-14), fase III (días 15-18), fase IV ( días 19-24) y fase V (25 a 30). El diseño experimental para la descripción del contenido de vesículas consta de dos niveles de comparación: (1) análisis de contenidos diferenciales de las diferentes poblaciones de vesículas en una misma fase del ciclo menstrual y para cada una de las fases y (2) análisis de contenidos diferenciales de la misma población de vesículas en cada fase del ciclo y para cada una de las poblaciones vesiculares. Esta caracterización de los contenidos vesiculares se realizará mediante técnicas de espectrometría de masas para analizar la composición de proteínas, lípidos y otros pequeños metabolitos. Su presencia pretende estar relacionada tanto con el momento del ciclo como con una función fisiológica normal del endometrio. Por otro lado, se realizará el análisis del contenido de ADN y ARN de estas poblaciones vesiculares mediante secuenciación masiva. El objetivo aquí es analizar la transmisión de funcionalidades a las células diana así como la potencial utilidad predictiva de estas moléculas para determinar el momento del ciclo menstrual.