Isolering og karakterisering af de ekstracellulære vesikler udskilt af det menneskelige endometrium

I de sidste årtier er emissionen af ​​membranlukkede rum, mere almindeligt betragtet som ekstracellulære vesikler, blevet etableret som en ny kommunikationsmekanisme enten mellem celler i en kompleks organisme, mellem encellede organismer eller mellem encellede organismer og vært. Disse vesikler er blevet beskrevet i alle kropsvæsker og er i øjeblikket klassificeret i tre typer i henhold til den mekanisme, hvorved de dannes: exosomer, med størrelser fra 30 til 150 nm (dannet intracellulært); mikrovesikler, mellem 100 og 1000 nm (dannet fra cellemembranen) og apoptotiske legemer, med størrelser større end 1 µm (fremstillet af celler, der gennemgår programmeret celledød).

Endometrievæske er en tyktflydende væske til stede i livmoderhulen, der stammer fra de forskellige celletyper, der danner livmoderen og serumeksudater. Det giver et præcist billede af den kontekst, hvori embryonet implanteres og kan hentes ud med en minimalt invasiv teknik.

Hovedformålet med denne pilotundersøgelse er at isolere og karakterisere de ekstracellulære vesikler, der udskilles af endometriet til endometrievæsken, hvilket er første gang, at denne kendsgerning bliver beskrevet. Det er beregnet til at standardisere en metode til isolering af de forskellige vesikelpopulationer, der er til stede i endometrievæsken (dvs.: apoptotiske legemer, mikrovesikler og exosomer), baseret på serielle differentielle centrifugeringer og filtrering. Morfologisk karakterisering af de isolerede vesikler vil blive udført på tre niveauer: undersøgelse af den eksterne morfologi ved transmissionselektronmikroskopi, karakterisering af de forskellige vesikelpopulationers overflademarkører ved Western Blot og analyse af vesikelpopulationernes størrelsesfordelinger ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse.

Anden del af undersøgelsen er rettet mod at vurdere indholdet af de ekstracellulære vesikler gennem hele menstruationscyklussen. Til dette formål er en kanonisk menstruationscyklus på 28 til 30 dage blevet klassificeret i 5 faser: fase I (dage 0-8), fase II (dage 9-14), fase III (dage 15-18), fase IV ( dag 19-24) og fase V (25 til 30). Det eksperimentelle design for beskrivelse af vesiklernes indhold består af to sammenligningsniveauer: (1) analyse af differentielt indhold i de forskellige populationer af vesikler i samme fase af menstruationscyklussen og for hver af faserne og (2) analyse af differentielt indhold af den samme population af vesikler i hver fase af cyklussen og for hver af de vesikulære populationer. Denne karakterisering af det vesikulære indhold vil blive lavet ved hjælp af massespektrometriteknikker til at analysere sammensætningen af ​​protein, lipid og andre små metabolitter. Deres tilstedeværelse sigter mod at være relateret både til cyklusøjeblikket og til en normal fysiologisk funktion af endometriet. På den anden side vil der blive udført analyse af DNA- og RNA-indhold i disse vesikulære populationer ved massiv sekventering. Målet her er at analysere overførslen af ​​funktionaliteter til målceller såvel som den potentielle forudsigelige nytte af disse molekyler til at bestemme tidspunktet for menstruationscyklussen.