Izolacja i charakterystyka pęcherzyków pozakomórkowych wydzielanych przez ludzkie endometrium

W ostatnich dziesięcioleciach emisja przedziałów otoczonych błoną, powszechnie uważana za pęcherzyki pozakomórkowe, została ustalona jako nowy mechanizm komunikacji między komórkami złożonego organizmu, między organizmami jednokomórkowymi lub między organizmem jednokomórkowym a gospodarzem. Pęcherzyki te zostały opisane we wszystkich płynach ustrojowych i obecnie dzielą się na trzy typy w zależności od mechanizmu ich powstawania: egzosomy o rozmiarach w zakresie od 30 do 150 nm (powstałe wewnątrzkomórkowo); mikropęcherzyki o wielkości od 100 do 1000 nm (utworzone z błony komórkowej) i ciałka apoptotyczne o rozmiarach większych niż 1 µm (wytwarzane przez komórki przechodzące programowaną śmierć komórki).

Płyn endometrialny jest lepką cieczą obecną w jamie macicy, pochodzącą z różnych typów komórek tworzących wysięki macicy i surowicy. Daje dokładny obraz kontekstu, w którym zagnieżdża się zarodek i można go pobrać minimalnie inwazyjną techniką.

Głównym celem tego badania pilotażowego jest wyizolowanie i scharakteryzowanie zewnątrzkomórkowych pęcherzyków wydzielanych przez endometrium do płynu endometrialnego, ponieważ fakt ten jest opisywany po raz pierwszy. Ma na celu standaryzację metody izolacji różnych populacji pęcherzyków obecnych w płynie endometrialnym (tj. ciałek apoptotycznych, mikropęcherzyków i egzosomów), w oparciu o seryjne wirowanie różnicowe i filtrację. Charakterystyka morfologiczna wyizolowanych pęcherzyków zostanie przeprowadzona na trzech poziomach: badanie morfologii zewnętrznej za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, charakterystyka markerów powierzchniowych różnych populacji pęcherzyków metodą Western Blot oraz analiza dystrybucji wielkości populacji pęcherzyków za pomocą analizy śledzenia nanocząstek.

Druga część badania ukierunkowana jest na ocenę zawartości pęcherzyków pozakomórkowych w całym cyklu menstruacyjnym. W tym celu kanoniczny cykl menstruacyjny trwający od 28 do 30 dni został podzielony na 5 faz: faza I (dni 0-8), faza II (dni 9-14), faza III (dni 15-18), faza IV ( dni 19-24) i faza V (25-30). Schemat eksperymentu opisu zawartości pęcherzyków składa się z dwóch poziomów porównania: (1) analiza zróżnicowanej zawartości pęcherzyków w różnych populacjach pęcherzyków w tej samej fazie cyklu miesiączkowego i dla każdej z faz oraz (2) analiza zróżnicowanej zawartości pęcherzyków tę samą populację pęcherzyków w każdej fazie cyklu i dla każdej populacji pęcherzyków. Ta charakterystyka zawartości pęcherzyków zostanie przeprowadzona przy użyciu technik spektrometrii mas w celu analizy składu białek, lipidów i innych małych metabolitów. Ich obecność ma być związana zarówno z momentem cyklu, jak i prawidłową fizjologiczną funkcją endometrium. Z drugiej strony zostanie przeprowadzona analiza zawartości DNA i RNA tych populacji pęcherzykowych za pomocą masowego sekwencjonowania. Celem jest tutaj analiza przekazywania funkcji do komórek docelowych, a także potencjalna predykcyjna przydatność tych cząsteczek do określenia momentu cyklu miesiączkowego.