Isolamento e caratterizzazione delle vescicole extracellulari secrete dall'endometrio umano

Negli ultimi decenni, l'emissione di compartimenti racchiusi in membrane, più comunemente considerati vescicole extracellulari, si è affermata come un nuovo meccanismo di comunicazione sia tra cellule di un organismo complesso, tra organismi unicellulari o tra organismo unicellulare e ospite. Queste vescicole sono state descritte in tutti i fluidi corporei e sono attualmente classificate in tre tipi a seconda del meccanismo con cui si formano: esosomi, con dimensioni che vanno da 30 a 150 nm (formate a livello intracellulare); microvescicole, tra 100 e 1000 nm (formate dalla membrana cellulare) e corpi apoptotici, con dimensioni superiori a 1 µm (prodotti da cellule in fase di morte cellulare programmata).

Il fluido endometriale è un liquido viscoso presente nella cavità uterina originato dai diversi tipi di cellule che formano l'utero e dagli essudati sierici. Offre una visione precisa del contesto in cui l'embrione si impianta e può essere recuperato con una tecnica minimamente invasiva.

L'obiettivo principale di questo studio pilota è isolare e caratterizzare le vescicole extracellulari secrete dall'endometrio nel fluido endometriale, essendo questa la prima volta che questo fatto viene descritto. Si intende standardizzare un metodo per l'isolamento delle diverse popolazioni di vescicole presenti all'interno del fluido endometriale (es: corpi apoptotici, microvescicole ed esosomi), basato su centrifugazioni differenziali seriali e filtrazione. La caratterizzazione morfologica delle vescicole isolate sarà effettuata a tre livelli: studio della morfologia esterna mediante microscopia elettronica a trasmissione, caratterizzazione dei marcatori di superficie delle diverse popolazioni di vescicole mediante Western Blot e analisi delle distribuzioni dimensionali delle popolazioni di vescicole mediante Nanoparticle Tracking Analysis.

La seconda parte dello studio è diretta a valutare il contenuto delle vescicole extracellulari durante tutto il ciclo mestruale. A tal fine, un ciclo mestruale canonico di 28-30 giorni è stato classificato in 5 fasi: fase I (giorni 0-8), fase II (giorni 9-14), fase III (giorni 15-18), fase IV ( giorni 19-24) e fase V (da 25 a 30). Il disegno sperimentale per la descrizione del contenuto delle vescicole prevede due livelli di confronto: (1) analisi dei contenuti differenziali delle diverse popolazioni di vescicole nella stessa fase del ciclo mestruale e per ciascuna delle fasi e (2) analisi dei contenuti differenziali di la stessa popolazione di vescicole in ciascuna fase del ciclo e per ciascuna delle popolazioni vescicolari. Questa caratterizzazione del contenuto vescicolare sarà effettuata utilizzando tecniche di spettrometria di massa per analizzare la composizione proteica, lipidica e di altri piccoli metaboliti. La loro presenza vuole essere correlata sia al momento del ciclo che ad una normale funzione fisiologica dell'endometrio. D'altra parte, verrà eseguita l'analisi del contenuto di DNA e RNA di queste popolazioni vescicolari mediante sequenziamento massivo. L'obiettivo qui è analizzare la trasmissione di funzionalità alle cellule bersaglio nonché la potenziale utilità predittiva di queste molecole per determinare il momento del ciclo mestruale.