Isolamento e Caracterização das Vesículas Extracelulares Secretadas pelo Endométrio Humano

Nas últimas décadas, a emissão de compartimentos envoltos por membranas, mais comumente considerados como vesículas extracelulares, tem se estabelecido como um novo mecanismo de comunicação seja entre células de um organismo complexo, entre organismos unicelulares ou entre organismo unicelular e hospedeiro. Essas vesículas foram descritas em todos os fluidos corporais e atualmente são classificadas em três tipos de acordo com o mecanismo pelo qual são formadas: exossomos, com tamanhos que variam de 30 a 150 nm (formados intracelularmente); microvesículas, entre 100 e 1000 nm (formadas a partir da membrana celular) e corpos apoptóticos, com tamanhos superiores a 1 µm (produzidos por células em morte celular programada).

O fluido endometrial é um líquido viscoso presente na cavidade uterina proveniente dos diferentes tipos de células que formam o útero e exsudatos séricos. Ele oferece uma visão precisa do contexto em que o embrião se implanta e pode ser recuperado por uma técnica minimamente invasiva.

O principal objetivo deste estudo piloto é isolar e caracterizar as vesículas extracelulares secretadas pelo endométrio para o fluido endometrial, sendo esta a primeira vez que este fato é descrito. Pretende-se padronizar um método para o isolamento das diferentes populações de vesículas presentes no fluido endometrial (i.e.: corpos apoptóticos, microvesículas e exossomas), baseado em centrifugações e filtrações diferenciais seriadas. A caracterização morfológica das vesículas isoladas será feita em três níveis: estudo da morfologia externa por microscopia eletrônica de transmissão, caracterização dos marcadores de superfície das diferentes populações de vesículas por Western Blot e análise das distribuições de tamanho das populações de vesículas por Nanoparticle Tracking Analysis.

A segunda parte do estudo é direcionada para avaliar o conteúdo das vesículas extracelulares ao longo do ciclo menstrual. Para tanto, um ciclo menstrual canônico de 28 a 30 dias foi classificado em 5 fases: fase I (dias 0-8), fase II (dias 9-14), fase III (dias 15-18), fase IV ( dias 19-24) e fase V (25 a 30). O desenho experimental para a descrição do conteúdo das vesículas consiste em dois níveis de comparação: (1) análise do conteúdo diferencial das diferentes populações de vesículas na mesma fase do ciclo menstrual e para cada uma das fases e (2) análise do conteúdo diferencial de a mesma população de vesículas em cada fase do ciclo e para cada uma das populações vesiculares. Esta caracterização do conteúdo vesicular será feita utilizando técnicas de espectrometria de massas para analisar a composição de proteínas, lipídeos e outros pequenos metabólitos. A sua presença pretende estar relacionada tanto com o momento do ciclo como com uma função fisiológica normal do endométrio. Por outro lado, será realizada a análise do conteúdo de DNA e RNA dessas populações vesiculares por sequenciamento massivo. O objetivo aqui é analisar a transmissão de funcionalidades para células-alvo, bem como a potencial utilidade preditiva dessas moléculas para determinar o momento do ciclo menstrual.