Selekce neapoptotických lidských spermií pro oplodnění in vitro pomocí magneticky aktivovaného třídění buněk (MACS) (MACS-HS)

Studie na neplodných párech prokázaly, že mužský faktor hraje roli v neplodnosti. Spermie mohou představovat poškození na molekulárních úrovních, které mají vliv na oplodnění a vývoj embrya. Jedno z těchto molekulárních poškození představuje fragmentace deoxyribonukleové kyseliny (DNA), jejíž negativní dopad na embryologický výsledek se objevuje během aktivace genomu po oplodnění a také koreluje se zvýšenou mírou potratů.

Fragmentace DNA představuje jeden z pozdních projevů apoptózy. Identifikace spermií vykazujících fragmentaci DNA (apoptotická spermie) vyžaduje fixaci a barvení. Tuto metodu proto nelze v klinické praxi použít k selekci neapoptotických spermií pro ICSI. Tento výběr je však možný pomocí magneticky aktivovaného třídění buněk (MACS). Postup je založen na identifikaci a depleci spermií vykazujících časný marker apoptózy, konkrétně externalizaci fosfatidylserinu (PS), pomocí schopnosti Annexinu V rozpoznat tento antigen v plazmatické membráně apoptotických spermií. Po MACS lze frakci, která je obohacena o neapoptotické buňky (Annexin V-negativní buňky), dále použít pro klinickou aplikaci.

Systém MACS využívá separační kolonu umístěnou v magnetickém poli a činidlo Annexin-V označené paramagnetickými kuličkami.

Zpočátku bude vzorek spermatu podroben centrifugaci s gradientem hustoty (DGC). Získaný vzorek bude rozdělen na 2 frakce: jedna frakce bude podrobena magnetickému třídění (frakce 1) a druhá frakce bude představovat kontrolní (bez třídění; frakce 2).

Buňky z frakce 1 budou inkubovány s Annexinem-V a poté projdou separační kolonou umístěnou v magnetickém poli. Apoptotické buňky (buňky pozitivní na Annexin V) budou selektivně zadrženy v koloně. Neapoptotické buňky, které nejsou značeny Annexinem V, projdou kolonou a budou shromážděny pro další použití.

V okamžiku ICSI budou sourozenecké zralé oocyty inseminovány spermiemi z frakce 1 (obohacené o neapoptotické buňky) nebo z frakce 2 (kontrolní, konvenčně připravená spermie). Po ICSI budou všechny inseminované oocyty individuálně kultivovány za stejných podmínek ve stejné kultivační misce. Výběr embrya (embryí) pro transfer bude založen na kvalitě embrya. Nadpočetná kvalitní embrya z obou ramen budou zamražena pro další použití.

Cílem této studie je zjistit, zda použití MACS zlepšuje kvalitu/využitelnost embryí u párů s vysokou mírou fragmentace DNA spermií. Aby se zabránilo variacím mezi pacienty, je studie navržena jako studie sourozeneckých oocytů. Popisná statistika bude provedena analýzou mediánu, průměru, podílů, směrodatné odchylky, rozsahů a 95% intervalů spolehlivosti podle potřeby. K porovnání primárních a sekundárních výsledků mezi skupinami budou podle potřeby použity standardní parametrické a neparametrické testy. Výpočet velikosti vzorku: počet 142 zralých oocytů v každém rameni bude nezbytný k dosažení 80% síly detekce, což je signifikantní na 5% úrovni, zvýšení primární výsledné míry z 13 % v kontrolní skupině na 26 % v experimentální skupina.