Ei-apoptoottisten ihmisen siittiöiden valinta in vitro -hedelmöitykseen käyttämällä magneettista aktivoitua solulajittelua (MACS) (MACS-HS)

Lapsettomilla pariskunnilla tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että miestekijällä on rooli hedelmättömyydessä. Siittiöt voivat aiheuttaa vaurioita molekyylitasoilla, jotka vaikuttavat hedelmöittymiseen ja alkion kehitykseen. Yhtä näistä molekyylivaurioista edustaa deoksiribonukleiinihapon (DNA) fragmentoituminen, jonka negatiivinen vaikutus alkion lopputulokseen ilmenee genomin aktivaation aikana hedelmöityksen jälkeen ja korreloi myös lisääntyneen keskenmenon kanssa.

DNA:n fragmentoituminen on yksi apoptoosin myöhäisistä ilmenemismuodoista. DNA-fragmentoitumista (apoptoottisia siittiöitä) osoittavien siittiöiden tunnistaminen vaatii kiinnitystä ja värjäystä. Siksi tätä menetelmää ei voida soveltaa kliinisessä käytännössä ei-apoptoottisten siittiöiden valitsemiseen ICSI:lle. Tämä valinta on kuitenkin mahdollista käyttämällä magneettiaktivoitua solujen lajittelua (MACS). Toimenpide perustuu apoptoosin varhaisen merkkiaineen eli fosfatidyyliseriinin (PS) ulkoistumisen osoittavien siittiöiden tunnistamiseen ja hävittämiseen käyttämällä anneksiini V:n kykyä tunnistaa tämä antigeeni apoptoottisten siittiösolujen plasmamembraanissa. MACS:n jälkeen fraktiota, joka on rikastettu ei-apoptoottisilla soluilla (anneksiini V-negatiiviset solut), voidaan käyttää edelleen kliiniseen käyttöön.

MACS-järjestelmä käyttää magneettikenttään sijoitettua erotuskolonnia ja paramagneettisilla helmillä merkittyä Annexin-V-reagenssia.

Aluksi siemennestenäytteelle tehdään tiheysgradienttisentrifugointi (DGC). Saatu näyte jaetaan kahteen jakeeseen: toinen fraktio magneettilajitteluun (fraktio 1) ja toinen fraktio edustaa kontrollia (ei lajittelua; jae 2).

Fraktion 1 soluja inkuboidaan anneksiini-V:n kanssa ja viedään sitten magneettikentässä sijaitsevan erotuskolonnin läpi. Apoptoottiset solut (anneksiini V-positiiviset solut) jäävät selektiivisesti kolonniin. Ei-apoptoottiset solut, joita ei ole merkitty anneksiini V:llä, kulkevat kolonnin läpi ja kerätään myöhempää käyttöä varten.

ICSI-hetkellä sisarusten kypsät munasolut siemennetään siittiöillä fraktiosta 1 (rikastettu ei-apoptoottisilla soluilla) tai fraktiosta 2 (kontrolli, tavanomaisesti valmistettu siittiö). ICSI:n jälkeen kaikkia inseminoituja munasoluja viljellään yksittäin samoissa olosuhteissa samassa viljelymaljassa. Siirrettävän alkion (alkioiden) valinta perustuu alkion laatuun. Molempien käsien ylimääräiset hyvälaatuiset alkiot jäädytetään myöhempää käyttöä varten.

Tämän tutkimuksen tavoitteena on selvittää, parantaako MACS:n käyttö alkion laatua/käyttöastetta pariskunnilla, joilla on korkea siittiöiden DNA:n fragmentaatioaste. Potilaiden välisen vaihtelun välttämiseksi tutkimus on suunniteltu sisarusoosyyttitutkimukseksi. Kuvaavat tilastot tehdään analysoimalla mediaani, keskiarvo, suhteet, keskihajonnat, vaihteluvälit ja 95 %:n luottamusvälit tarpeen mukaan. Standardiparametrisia ja ei-parametrisia testejä käytetään tarpeen mukaan primääristen ja toissijaisten tulosten vertaamiseen ryhmien välillä. Näytteen koon laskenta: 142 kypsää munasolua kussakin käsivarressa tarvitaan, jotta saavutetaan 80 %:n havaitsemisteho, mikä merkitsee 5 %:n tasolla, että ensisijaisen tulosmitan kasvu kontrolliryhmän 13 %:sta 26 %:iin. kokeellinen ryhmä.