Selección de espermatozoides humanos no apoptóticos para la fertilización in vitro mediante el uso de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) (MACS-HS)

Los estudios de parejas infértiles han demostrado que el factor masculino juega un papel en la infertilidad. Los espermatozoides pueden presentar daños a nivel molecular que inciden en la fecundación y el desarrollo embrionario. Uno de estos daños moleculares está representado por la fragmentación del ácido desoxirribonucleico (ADN), cuyo impacto negativo en el resultado embriológico aparece durante la activación del genoma después de la fertilización y también se correlaciona con una mayor tasa de aborto espontáneo.

La fragmentación del ADN representa una de las manifestaciones tardías de la apoptosis. La identificación de espermatozoides que muestran fragmentación de ADN (espermatozoides apoptóticos) requiere fijación y tinción. Por lo tanto, este método no se puede aplicar en la práctica clínica para seleccionar espermatozoides no apoptóticos para ICSI. Sin embargo, esta selección es posible mediante el uso de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). El procedimiento se basa en la identificación y depleción de espermatozoides que presenten el marcador temprano de apoptosis, es decir, la externalización de fosfatidilserina (PS), utilizando la capacidad de la Anexina V para reconocer este antígeno en la membrana plasmática de los espermatozoides apoptóticos. Después de MACS, la fracción que está enriquecida en células no apoptóticas (células negativas para anexina V) se puede utilizar para aplicaciones clínicas.

El sistema MACS utiliza una columna de separación colocada en un campo magnético y un reactivo de anexina-V marcado con perlas paramagnéticas.

Inicialmente, la muestra de semen estará sujeta a centrifugación en gradiente de densidad (DGC). La muestra obtenida se dividirá en 2 fracciones: una fracción será objeto de clasificación magnética (fracción 1) y la otra fracción representará el control (sin clasificación; fracción 2).

Las células de la fracción 1 se incubarán con Anexina-V y luego se pasarán por la columna de separación ubicada en un campo magnético. Las células apoptóticas (células positivas para anexina V) se retendrán selectivamente en la columna. Las células no apoptóticas, que no están marcadas por la anexina V, pasarán a través de la columna y se recogerán para su uso posterior.

En el momento de la ICSI, los ovocitos maduros hermanos serán inseminados con espermatozoides de la fracción 1 (enriquecidos en células no apoptóticas) o de la fracción 2 (control, espermatozoides preparados convencionalmente). Tras la ICSI, todos los ovocitos inseminados se cultivarán individualmente en las mismas condiciones en la misma placa de cultivo. La elección de los embriones para la transferencia se basará en la calidad del embrión. Los embriones supernumerarios de buena calidad de ambos brazos se congelarán para su uso posterior.

El presente estudio tiene como objetivo determinar si el uso de MACS mejora la calidad/tasa de utilización del embrión en parejas con alta tasa de fragmentación del ADN espermático. Para evitar la variación entre pacientes, el estudio está diseñado como un estudio de ovocitos hermanos. Las estadísticas descriptivas se realizarán mediante el análisis de la mediana, la media, las proporciones, la desviación estándar, los rangos y los intervalos de confianza del 95 %, según corresponda. Se utilizarán pruebas estándar paramétricas y no paramétricas, según corresponda, para comparar los resultados primarios y secundarios entre los grupos. Cálculo del tamaño de la muestra: será necesario un número de 142 ovocitos maduros en cada brazo para lograr un poder de detección del 80 %, significativo al nivel del 5 %, un aumento en la medida de resultado primaria del 13 % en el grupo de control al 26 % en el grupo experimental.