Auswahl nicht apoptotischer menschlicher Spermien für die In-Vitro-Fertilisation mithilfe von Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) (MACS-HS)

Studien an unfruchtbaren Paaren haben gezeigt, dass der männliche Faktor bei der Unfruchtbarkeit eine Rolle spielt. Spermatozoen können Schäden auf molekularer Ebene aufweisen, die sich auf die Befruchtung und Embryonalentwicklung auswirken. Einer dieser molekularen Schäden ist die Fragmentierung der Deoxyribonukleinsäure (DNA), deren negativer Einfluss auf das embryologische Ergebnis während der Genomaktivierung nach der Befruchtung auftritt und auch mit einer erhöhten Fehlgeburtsrate korreliert.

Die DNA-Fragmentierung ist eine der späten Manifestationen der Apoptose. Die Identifizierung von Spermien mit DNA-Fragmentierung (apoptotische Spermien) erfordert Fixierung und Färbung. Daher kann diese Methode in der klinischen Praxis nicht angewendet werden, um nicht-apoptotische Spermien für die ICSI zu selektieren. Diese Selektion ist jedoch durch die Verwendung von magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) möglich. Das Verfahren basiert auf der Identifizierung und Depletion von Spermien, die den frühen Marker der Apoptose zeigen, nämlich die Externalisierung von Phosphatidylserin (PS), indem die Fähigkeit von Annexin V genutzt wird, dieses Antigen in der Plasmamembran apoptotischer Spermien zu erkennen. Nach MACS kann die an nicht-apoptotischen Zellen angereicherte Fraktion (Annexin V-negative Zellen) für die klinische Anwendung weiterverwendet werden.

Das MACS-System verwendet eine Trennsäule, die in einem Magnetfeld angeordnet ist, und ein Annexin-V-Reagenz, das mit paramagnetischen Kügelchen markiert ist.

Zunächst wird die Samenprobe einer Dichtegradientenzentrifugation (DGC) unterzogen. Die erhaltene Probe wird in 2 Fraktionen geteilt: Eine Fraktion wird magnetisch sortiert (Fraktion 1) und die andere Fraktion stellt die Kontrolle dar (keine Sortierung; Fraktion 2).

Die Zellen aus Fraktion 1 werden mit Annexin-V inkubiert und dann durch die in einem Magnetfeld befindliche Trennsäule geleitet. Die apoptotischen Zellen (Annexin V-positive Zellen) werden selektiv in der Säule zurückgehalten. Die nicht apoptotischen Zellen, die nicht durch Annexin V markiert sind, passieren die Säule und werden zur weiteren Verwendung gesammelt.

Zum Zeitpunkt der ICSI werden reife Eizellen von Geschwistern mit Spermien aus Fraktion 1 (angereichert mit nicht-apoptotischen Zellen) oder aus Fraktion 2 (Kontrolle, konventionell präparierte Spermien) besamt. Nach der ICSI werden alle befruchteten Eizellen einzeln unter den gleichen Bedingungen in der gleichen Kulturschale kultiviert. Die Auswahl des/der Embryo(s) für den Transfer basiert auf der Qualität des Embryos. Die überzähligen Embryonen von guter Qualität aus beiden Armen werden zur weiteren Verwendung eingefroren.

Die vorliegende Studie zielt darauf ab festzustellen, ob die Verwendung von MACS die Embryonenqualität/Nutzungsrate bei Paaren mit hoher Spermien-DNA-Fragmentierungsrate verbessert. Um Schwankungen zwischen den Patienten zu vermeiden, ist die Studie als Geschwister-Oozytenstudie konzipiert. Beschreibende Statistiken werden durchgeführt, indem Median, Mittelwert, Anteile, Standardabweichung, Bereiche und 95 %-Konfidenzintervalle nach Bedarf analysiert werden. Parametrische und nicht-parametrische Standardtests werden nach Bedarf verwendet, um die primären und sekundären Ergebnisse zwischen den Gruppen zu vergleichen. Berechnung der Stichprobengröße: Eine Anzahl von 142 reifen Oozyten in jedem Arm ist erforderlich, um eine 80-prozentige Erkennungsleistung zu erreichen, die auf dem 5-%-Niveau als signifikant gilt, und zwar einen Anstieg des primären Ergebnismaßes von 13 % in der Kontrollgruppe auf 26 % in die Experimentalgruppe.