Seleção de espermatozoides humanos não apoptóticos para fertilização in vitro usando seleção de células ativadas por magnetismo (MACS) (MACS-HS)

Estudos de casais inférteis demonstraram que o fator masculino desempenha um papel na infertilidade. Os espermatozóides podem apresentar danos em níveis moleculares que afetam a fertilização e o desenvolvimento do embrião. Um desses danos moleculares é representado pela fragmentação do ácido desoxirribonucleico (DNA), cujo impacto negativo no resultado embriológico aparece durante a ativação do genoma após a fertilização e também está correlacionado com o aumento da taxa de aborto espontâneo.

A fragmentação do DNA representa uma das manifestações tardias da apoptose. A identificação de espermatozoides com fragmentação do DNA (espermatozoides apoptóticos) requer fixação e coloração. Portanto, este método não pode ser aplicado na prática clínica para selecionar espermatozóides não apoptóticos para ICSI. No entanto, essa seleção é possível usando classificação de células ativadas por magnetismo (MACS). O procedimento baseia-se na identificação e depleção de espermatozóides que apresentem o marcador precoce de apoptose, nomeadamente a exteriorização da fosfatidilserina (PS), utilizando a capacidade da Anexina V para reconhecer este antigénio na membrana plasmática de espermatozóides apoptóticos. Após o MACS, a fração que é enriquecida em células não apoptóticas (células negativas para anexina V) pode ser posteriormente utilizada para aplicação clínica.

O sistema MACS faz uso de uma coluna de separação colocada em um campo magnético e do reagente Anexina-V marcado com esferas paramagnéticas.

Inicialmente, a amostra de sêmen será submetida à Centrifugação por Gradiente de Densidade (DGC). A amostra obtida será dividida em 2 frações: uma fração será submetida à triagem magnética (fração 1) e a outra fração representará o controle (sem triagem; fração 2).

As células da fração 1 serão incubadas com Anexina-V e depois passadas pela coluna de separação localizada em campo magnético. As células apoptóticas (células positivas para anexina V) serão seletivamente retidas na coluna. As células não apoptóticas, não sendo marcadas pela Anexina V, passarão pela coluna e serão coletadas para uso posterior.

No momento da ICSI, os ovócitos maduros dos irmãos serão inseminados com espermatozóides da fração 1 (enriquecidos com células não apoptóticas) ou da fração 2 (controle, espermatozóides preparados convencionalmente). Após a ICSI, todos os oócitos inseminados serão cultivados individualmente nas mesmas condições na mesma placa de cultura. A escolha do(s) embrião(es) para transferência será baseada na qualidade do embrião. Os embriões supranumerários de boa qualidade de ambos os braços serão congelados para uso posterior.

O presente estudo visa determinar se o uso de MACS melhora a qualidade/taxa de utilização do embrião em casais com alta taxa de fragmentação do DNA espermático. Para evitar variação entre pacientes, o estudo é concebido como um estudo de oócitos irmãos. A estatística descritiva será realizada analisando mediana, média, proporções, desvio padrão, intervalos e intervalos de confiança de 95%, conforme apropriado. Testes paramétricos e não paramétricos padrão serão usados, conforme apropriado, para comparar resultados primários e secundários entre os grupos. Cálculo do tamanho da amostra: será necessário um número de 142 oócitos maduros em cada braço para atingir 80% de poder de detecção, tão significativo no nível de 5%, um aumento na medida de desfecho primário de 13% no grupo controle para 26% no o grupo experimental.