Selekcja nieapoptotycznych ludzkich plemników do zapłodnienia in vitro za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) (MACS-HS)

Badania niepłodnych par wykazały, że czynnik męski odgrywa rolę w niepłodności. Plemniki mogą powodować uszkodzenia na poziomie molekularnym, które mają wpływ na zapłodnienie i rozwój zarodka. Jednym z takich uszkodzeń molekularnych jest fragmentacja kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), której negatywny wpływ na wynik embriologiczny pojawia się podczas aktywacji genomu po zapłodnieniu i jest również skorelowany ze zwiększoną częstością poronień.

Fragmentacja DNA jest jedną z późnych manifestacji apoptozy. Identyfikacja plemników wykazujących fragmentację DNA (plemniki apoptotyczne) wymaga utrwalenia i barwienia. Dlatego ta metoda nie może być stosowana w praktyce klinicznej do selekcji nieapoptotycznych plemników do ICSI. Jednak ta selekcja jest możliwa dzięki zastosowaniu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Procedura polega na identyfikacji i wyczerpaniu plemników wykazujących wczesny marker apoptozy, jakim jest eksternalizacja fosfatydyloseryny (PS), poprzez wykorzystanie zdolności aneksyny V do rozpoznawania tego antygenu w błonie komórkowej apoptotycznych plemników. Po MACS frakcja, która jest wzbogacona w komórki nieapoptotyczne (komórki bez aneksyny V) może być dalej wykorzystywana do zastosowań klinicznych.

System MACS wykorzystuje kolumnę rozdzielającą umieszczoną w polu magnetycznym oraz odczynnik Annexin-V znakowany paramagnetycznymi kulkami.

Początkowo próbka nasienia zostanie poddana wirowaniu w gradiencie gęstości (DGC). Otrzymana próbka zostanie podzielona na 2 frakcje: jedna frakcja zostanie poddana sortowaniu magnetycznemu (frakcja 1), a druga frakcja będzie stanowić kontrolę (bez sortowania; frakcja 2).

Komórki z frakcji 1 będą inkubowane z aneksyną-V, a następnie przepuszczone przez kolumnę rozdzielającą umieszczoną w polu magnetycznym. Komórki apoptotyczne (komórki dodatnie względem aneksyny V) będą selektywnie zatrzymywane w kolumnie. Komórki nieapoptotyczne, nieznakowane aneksyną V, przejdą przez kolumnę i zostaną zebrane do dalszego wykorzystania.

W momencie ICSI dojrzałe komórki jajowe rodzeństwa zostaną zapłodnione plemnikami z frakcji 1 (wzbogacone w komórki nieapoptotyczne) lub z frakcji 2 (kontrolne, plemniki preparowane konwencjonalnie). Po ICSI wszystkie zapłodnione oocyty będą hodowane indywidualnie w tych samych warunkach w tej samej szalce hodowlanej. Wybór zarodka (zarodków) do transferu będzie oparty na jakości zarodka. Nadliczbowe zarodki dobrej jakości z obu ramion zostaną zamrożone do dalszego wykorzystania.

Niniejsze badanie ma na celu ustalenie, czy zastosowanie MACS poprawia jakość/wskaźnik wykorzystania zarodków u par z wysokim współczynnikiem fragmentacji DNA plemników. Aby uniknąć różnic między pacjentami, badanie zaprojektowano jako badanie oocytów rodzeństwa. Statystyki opisowe zostaną wykonane poprzez analizę mediany, średniej, proporcji, odchylenia standardowego, zakresów i 95% przedziałów ufności, odpowiednio. Standardowe testy parametryczne i nieparametryczne zostaną użyte, odpowiednio, do porównania głównych i drugorzędowych wyników między grupami. Obliczenie wielkości próby: liczba 142 dojrzałych oocytów w każdym ramieniu będzie konieczna do osiągnięcia 80% mocy wykrywania, istotnej na poziomie 5%, wzrostu pierwotnej miary wyniku z 13% w grupie kontrolnej do 26% w grupie kontrolnej grupa eksperymentalna.