Selezione di spermatozoi umani non apoptotici per la fecondazione in vitro mediante selezione di cellule attivate magneticamente (MACS) (MACS-HS)

Gli studi sulle coppie infertili hanno dimostrato che il fattore maschile gioca un ruolo nell'infertilità. Gli spermatozoi possono presentare danni a livello molecolare che hanno effetto sulla fecondazione e sullo sviluppo embrionale. Uno di questi danni molecolari è rappresentato dalla frammentazione dell'Acido DeossiriboNucleico (DNA) il cui impatto negativo sull'esito embriologico si manifesta durante l'attivazione del genoma dopo la fecondazione ed è anche correlato all'aumento del tasso di aborto spontaneo.

La frammentazione del DNA rappresenta una delle ultime manifestazioni dell'apoptosi. L'identificazione degli spermatozoi che mostrano la frammentazione del DNA (spermatozoi apoptotici) richiede fissazione e colorazione. Pertanto questo metodo non può essere applicato nella pratica clinica per selezionare spermatozoi non apoptotici per ICSI. Tuttavia, questa selezione è possibile utilizzando l'ordinamento cellulare attivato magneticamente (MACS). La procedura si basa sull'identificazione e la deplezione degli spermatozoi che mostrano il marcatore precoce dell'apoptosi, vale a dire l'esternalizzazione della fosfatidilserina (PS), utilizzando la capacità dell'Annessina V di riconoscere questo antigene nella membrana plasmatica degli spermatozoi apoptotici. Dopo il MACS, la frazione arricchita in cellule non apoptotiche (cellule negative per annessina V) può essere ulteriormente utilizzata per l'applicazione clinica.

Il sistema MACS utilizza una colonna di separazione posta in un campo magnetico e un reagente annessina-V marcato con biglie paramagnetiche.

Inizialmente, il campione di seme sarà sottoposto a Density Gradient Centrifugation (DGC). Il campione ottenuto sarà suddiviso in 2 frazioni: una frazione sarà soggetta a sorting magnetico (frazione 1) e l'altra frazione rappresenterà il controllo (no sorting; frazione 2).

Le cellule della frazione 1 saranno incubate con Annessina-V e quindi fatte passare attraverso la colonna di separazione situata in un campo magnetico. Le cellule apoptotiche (cellule Annexin V positive) saranno trattenute selettivamente nella colonna. Le cellule non apoptotiche, non essendo marcate dall'Annessina V, passeranno attraverso la colonna e saranno raccolte per un ulteriore utilizzo.

Al momento dell'ICSI, gli ovociti maturi di fratelli saranno inseminati con spermatozoi della frazione 1 (arricchiti in cellule non apoptotiche) o della frazione 2 (controllo, spermatozoi preparati convenzionalmente). Dopo l'ICSI, tutti gli ovociti inseminati saranno coltivati ​​individualmente nelle stesse condizioni nella stessa piastra di coltura. La scelta degli embrioni da trasferire si baserà sulla qualità degli embrioni. Gli embrioni soprannumerari di buona qualità di entrambe le braccia saranno congelati per un ulteriore utilizzo.

Il presente studio mira a determinare se l'uso di MACS migliora la qualità/tasso di utilizzo dell'embrione nelle coppie con un alto tasso di frammentazione del DNA dello sperma. Per evitare variazioni inter-paziente, lo studio è concepito come uno studio sugli ovociti di pari livello. Le statistiche descrittive saranno eseguite analizzando la mediana, la media, le proporzioni, la deviazione standard, gli intervalli e gli intervalli di confidenza al 95% a seconda dei casi. Saranno utilizzati test standard parametrici e non parametrici, a seconda dei casi, per confrontare i risultati primari e secondari tra i gruppi. Calcolo della dimensione del campione: sarà necessario un numero di 142 ovociti maturi in ciascun braccio per raggiungere l'80% di potere di rilevamento, significativo al livello del 5%, un aumento della misura dell'esito primario dal 13% nel gruppo di controllo al 26% nel il gruppo sperimentale