Akutní cvičení a regulace NK buněk ve tkáni a oběhu po blokádě IL-6R

Cíle:

Primární cíl:

• Prozkoumat souvislost mezi akutním cvičením, blokádou IL-6 a regulací NK v oběhu.
• Prozkoumat, zda cvičením aktivované NK-buňky mají jedinečný fenotyp pomocí jednobuněčného sekvenování RNA.

Sekundární cíle:

• Prozkoumat účinek akutního aerobního cvičení na počet NK buněk a aktivitu v oběhu, svalové a tukové tkáni u zdravých mladých mužů, aby bylo možné nepřímo prozkoumat cvičení jako protirakovinný lék.
• Posoudit kinetiku odpovědi NK-buněk a pokud možno chronologicky prozkoumat vzhled a místo pobytu aktivovaných NK-buněk.

Průzkumné cíle

• Vytvořit reprodukovatelný protokol pro sledování různých imunitních buněk a jejich zapojení do reakce na akutní zátěž u lidí
• Prozkoumat nové signální molekuly uvolňované ze svalů během cvičení s imunologickým významem.
• Zkoumat možnou roli cvičení indukovaného IL-6 na subjektivní pocity hladu a sytosti po cvičení a příjmu potravy. • Prozkoumat účinek blokády receptoru IL-6 na proteom a metabolom zátěže pomocí hmotnostní spektrometrie

Metody:

30 zdravých rekreačně aktivních mladých mužů bude zahrnuto do této akutní cvičební studie, ve které bude studována kinetika a regulace NK-buněk v reakci na akutní aerobní cvičení a blokádu IL-6R nebo placebo.

Studium se skládá ze 2 návštěv. Při zařazení (návštěva 1) všechny subjekty projdou hodnocením zahrnujícím: základní lékařský screening (auskultace, krevní tlak, EKG), stanovení tělesného složení (DXA), kardiovaskulární zdatnost (VO2max) a standardní biochemii krve nalačno, která bude okamžitě analyzována. Návštěva 2 se bude skládat ze svalové a tukové biopsie z dominantní nohy a břišního depa podkožního tuku (obojí za klidových podmínek), které pak budou fungovat jako referenční tkáň pro další analýzu tkáně. Poté bude před zahájením infuze IL-6R zajištěn 18G antekubitální periferní žilní přístup. 2 hodiny po infuzní proceduře podstoupí subjekty protokol akutního cvičení. Subjekty pak budou vystaveny vysoce intenzivnímu akutnímu aerobnímu cvičení s využitím cyklistického ergometru. Vzorky krve budou odebrány před infuzí a cvičením, během cvičení a také okamžitě, ½, 1, 1½ a 2 hodiny po cvičení a až 4 hodiny po cvičení v podstudii regulace chuti k jídlu. Vzorky krve budou okamžitě analyzovány na počet a diferenciaci leukocytů a také na biochemii plazmy. Kromě toho budou vzorky krve využity pro izolaci NK buněk s následným sekvenováním jednobuněčné RNA, distribucí imunitních buněk a schopností zabíjet rakovinné buňky. Dále budou odebrány a zmraženy vzorky plazmy pro pozdější stanovení kortizolu, prolaktinu a cirkulujících cytokinů, včetně, ale bez omezení, IL-6 a G-CSF. A konečně, v dílčí studii chuti k jídlu bude měřen inzulín, GLP-1 a volné mastné kyseliny.

Vzorky tkání budou získány 2 hodiny po cvičení pro optimalizaci analýzy genové exprese. Vzorky svalové i tukové tkáně budou analyzovány na zánětlivé a protizánětlivé markery, obsah NK buněk a fenotypizaci těchto NK buněk pomocí markerů získaných ze sekvenování jednotlivých buněk provedeného na NK-buňkách přenášených krví. Dále bude pomocí histologie hodnocena infiltrace imunitních buněk. Všechny vzorky tkáně budou odebrány pomocí Bergströmovy jehly za sterilních podmínek během lokální anestezie, aby se minimalizoval jakýkoli diskomfort nebo infekce související se vzorkem.

Po odebrání vzorku tkáně bude podáváno jídlo ad libitum, subjekty mohou jíst tolik, kolik mohou, ale jsou instruovány, aby nespotřebovaly nadměrnou spotřebu, protože zbytky jídla si mohou vzít domů. Paracetamol (1,5 g) bude podán k posouzení vyprazdňování žaludku.

Všichni účastníci absolvují 2 studijní návštěvy ve stejnou přibližnou denní dobu (9:00). Po dokončení studie bude veškerý zbývající materiál převeden do biobanky CFAS.

Subjekty: Zahrnutými subjekty bude 30 rekreačně aktivních, středně trénovaných, zdravých mladých mužů ve věku 18-40 let. Kritéria pro vyloučení jsou: kardiovaskulární, revmatologické a metabolické onemocnění, vrcholový sport nebo vysoký aerobní tréninkový stav. Chronické užívání nesteroidních protizánětlivých léků (NSAID) nebo jiných imunosupresiv.

Intervence: Subjekty budou randomizovány k akutnímu cvičení, s (n=15) nebo bez (n=15) před blokádou IL-6R. Cvičební intervence se bude skládat z vysoce náročného ≈45minutového intervalu, aerobního cvičení, prováděného na stacionárním cyklistickém ergometru. Po úvodním 5minutovém zahřátí při 50-60 % HRmax podstoupí subjekty sedm, slovně povzbuzovaných, 3minutových intervalech při HRmax nad 90 %, proložených 3 minutami šlapání s nízkou intenzitou. Vzorky krve budou odebrány před, během i okamžitě, ½, 1, 1½ a 2 hodiny po cvičení spolu s odběrem tkáně v časovém bodu 2 hodiny.

Pro posouzení regulace chuti k jídlu budou další vzorky krve odebrány 2h-4h po cvičení.

Statistické úvahy: Na základě dat z naší pilotní studie předpokládáme o ≈ 45 % nižší maximální mobilizaci NK buněk ve skupině s inhibicí IL6R ve srovnání s CON a 29 % rozdíl v nadiru NK buněk s nejnižšími hodnotami získanými ve skupině s inhibicí IL6R. Za předpokladu 5% úrovně významnosti ve dvoustranných testech musíme do každé skupiny zahrnout 9 pacientů, abychom dosáhli 90% síly pro detekci relativního rozdílu 45 % v intervenční skupině. Abychom zohlednili potenciální předčasné ukončení/vyloučení z důvodu poněkud invazivního nastavení, zařadíme celkem 30 pacientů (15 na skupinu).

Nábor: Subjekty budou získávány prostřednictvím forsøgsperson.dk nebo podobných stránek spolu s inzercí na příslušných stránkách.

Subjekty nás budou kontaktovat na CFAS a dostanou na výběr, zda chtějí dostávat studijní informace pr. telefon (čímž je odepřena možnost přihlížejícího) nebo osobní setkání v CFAS. Všechny tyto informace poskytne hlavní vyšetřovatel. Pokud má subjekt zájem slyšet více o studii, budou mu příslušné dokumenty zaslány e-mailem. Pokud má subjekt zájem o vstup do studie poté, co obdržel písemnou nebo ústní informaci, bude mít 24 hodin na zvážení účasti ve studii. Když byl subjekt informován buď telefonicky nebo tváří v tvář a přijme účast ve studii, bude pozván k návštěvě 1, kde bude získán písemný a informovaný souhlas (nebo podepsán a přinesen z domova účastníkem).

Rizika a nežádoucí reakce: Subjekty mohou pociťovat menší nepohodlí s ohledem na vzorky krve a tkáně. Odebraný objem krve je zanedbatelný a nebude spojen s žádným zdravotním rizikem. Veškeré odběry tkání budou prováděny za sterilních podmínek během lokální anestezie a budou tedy spojeny s malou bolestí nebo nepohodlím a velmi malým rizikem infekce. Během zátěžového testování mohou účastníci zaznamenat dušnost.

Inhibice IL-6R je obecně dobře tolerována s pouze několika vedlejšími účinky. Dávka paracetamolu je nízká a není spojena s žádným rizikem.

Kontaktní informace zúčastněného lékaře budou účastníkům poskytnuty při zařazení do studie, aby bylo možné nahlásit a vyřešit jakýkoli nežádoucí účinek.

Šíření výsledků studie: Pozitivní, negativní i neprůkazné výsledky budou publikovány v relevantních mezinárodních vědeckých časopisech.

Etické úvahy: Očekává se, že projekt způsobí omezená rizika, vedlejší účinky a nepohodlí. Všechny procedury budou provádět zkušení lékaři a fyziologové s odpovídající bezpečností. Tocilizumab je obecně dobře snášen a dávka paracetamolu je nízká. Zahrnuté subjekty mohou kdykoli a bez odůvodnění odvolat svůj souhlas s účastí ve studii. Věříme, že projekt je důležitý a přispěje kriticky novými informacemi o IL-6 modifikovatelné NK-buněčné reakci na akutní cvičení jak v oběhu, tak v tukové a svalové tkáni (protože o posledně jmenované jsou v současnosti velmi omezené znalosti).

Studie je považována za soubor nástrojů studie Lægemiddelstyrelsen, a tedy ne za farmaceutickou studii