Ejercicio agudo y regulación de células NK en tejido y circulación después del bloqueo de IL-6R

Objetivos:

Objetivo primario:

• Explorar la asociación entre ejercicio agudo, bloqueo de IL-6 y regulación de NK en circulación.
• Explorar si las células NK activadas por el ejercicio tienen un fenotipo único utilizando la secuenciación del ARN de una sola célula.

Objetivos secundarios:

• Explorar el efecto del ejercicio aeróbico agudo sobre el número y la actividad de las células NK en la circulación, el músculo y el tejido adiposo, en hombres jóvenes sanos, para explorar indirectamente el ejercicio como remedio anticancerígeno.
• Evaluar la cinética de la respuesta de las células NK y, si es posible, investigar cronológicamente la apariencia y el paradero de las células NK activadas.

Objetivos exploratorios

• Establecer un protocolo reproducible para rastrear varias células inmunitarias y su participación en la respuesta aguda al ejercicio en humanos.
• Investigar nuevas moléculas de señal liberadas por el músculo durante el ejercicio con importancia inmunológica.
• Investigar el posible papel de la IL-6 inducida por el ejercicio en los sentimientos subjetivos de hambre y saciedad después del ejercicio y la ingesta de alimentos. • Explorar el efecto del bloqueo del receptor de IL-6 en el proteoma y metaboloma del ejercicio, mediante espectrometría de masas

Métodos:

Se incluirán 30 varones jóvenes sanos y recreativamente activos en este estudio de ejercicio agudo en el que se estudiará la cinética y la regulación de las células NK en respuesta al ejercicio aeróbico agudo y al bloqueo de IL-6R o placebo.

El estudio consta de 2 visitas. En la inclusión (visita 1), todos los sujetos se someterán a una evaluación que abarcará: evaluación médica inicial (auscultación, presión arterial, ECG), determinación de la composición corporal (DXA), estado cardiovascular (VO2max) y bioquímica sanguínea estándar en ayunas que se analizará de inmediato. La visita 2 consistirá en una biopsia de músculo y grasa de la pierna dominante y un depósito de grasa subcutánea abdominal respectivamente (ambos en condiciones de reposo), que luego actuarán como tejido de referencia para el análisis posterior del tejido. Luego, se asegurará un acceso venoso periférico antecubital de 18G antes de comenzar con la infusión de IL-6R. 2 horas después del procedimiento de infusión, los sujetos se someterán a un protocolo de ejercicio agudo. Luego, los sujetos serán desafiados por una serie de ejercicios aeróbicos agudos de alta intensidad, utilizando una bicicleta ergométrica. Se extraerán muestras de sangre antes de la infusión y el ejercicio, durante el ejercicio, así como inmediatamente, ½, 1, 1½ y 2 h después del ejercicio y hasta 4 h después del ejercicio en el subestudio de regulación del apetito. Las muestras de sangre se analizarán inmediatamente para el recuento y la diferenciación de leucocitos, así como para la bioquímica del plasma. Además, las muestras de sangre se utilizarán para el aislamiento de células NK con la posterior secuenciación de ARN de células individuales, distribución de células inmunitarias y capacidad de eliminación de células cancerosas. Además, las muestras de plasma se recolectarán y congelarán para la posterior determinación de cortisol, prolactina y citocinas circulantes, incluidas, entre otras, IL-6 y G-CSF. Por último, en el subestudio de apetito se medirá insulina, GLP-1 y ácidos grasos libres.

Las muestras de tejido se obtendrán 2 horas después del ejercicio para optimizar el análisis de expresión génica. Tanto las muestras de músculo como las de tejido adiposo se analizarán en busca de marcadores inflamatorios y antiinflamatorios, contenido de células NK y fenotipado de estas células NK utilizando marcadores obtenidos de la secuenciación de células individuales, realizada en las células NK transmitidas por la sangre. Además, la infiltración de células inmunitarias se evaluará mediante histología. Todas las muestras de tejido se obtendrán con una aguja Bergström en condiciones estériles durante la anestesia local para minimizar cualquier molestia o infección relacionada con la muestra.

Después de la muestra de tejido, se servirá una comida ad libitum, los sujetos pueden comer todo lo que puedan, pero se les indica que no consuman en exceso, ya que cualquier comida sobrante puede llevarse a casa. Se administrará paracetamol (1,5 g) para evaluar el vaciamiento gástrico.

Todos los participantes realizarán las 2 visitas de estudio a la misma hora aproximada del día (9:00 a. m.) Una vez finalizado el estudio, cualquier material sobrante se transferirá al biobanco CFAS.

Sujetos: Los sujetos incluidos serán 30 hombres jóvenes sanos, recreativamente activos, moderadamente entrenados, de entre 18 y 40 años. Los criterios de exclusión son: enfermedades cardiovasculares, reumatológicas y metabólicas, deportes de élite o alto nivel de entrenamiento aeróbico. Uso crónico de medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) u otros inmunosupresores.

Intervención: Los sujetos serán asignados aleatoriamente a ejercicio agudo, con (n=15) o sin (n=15) bloqueo previo de IL-6R. La intervención de ejercicio consistirá en una serie de ejercicio aeróbico basada en intervalos de ≈45 minutos altamente exigente, realizada en una bicicleta ergométrica estacionaria. Después de un calentamiento inicial de 5 minutos al 50-60 % de la FCmáx, los sujetos realizarán siete intervalos de 3 minutos, estimulados verbalmente, por encima del 90 % de la FCmáx, intercalados con 3 minutos de pedaleo de baja intensidad. Se extraerán muestras de sangre antes, durante e inmediatamente, ½, 1, 1½ y 2 h después del ejercicio junto con muestras de tejido a las 2 h.

Para evaluar la regulación del apetito, se extraerán más muestras de sangre entre 2 y 4 horas después del ejercicio.

Consideraciones estadísticas: según los datos de nuestro estudio piloto, anticipamos una movilización máxima de células NK ≈ 45 % más baja en el grupo de inhibición de IL6R en comparación con CON y una diferencia del 29 % en el nadir de células NK con los valores más bajos obtenidos en el grupo de inhibición de IL6R. Suponiendo un nivel de significancia del 5 % en las pruebas bilaterales, necesitamos incluir 9 pacientes en cada grupo para lograr un poder del 90 % para detectar una diferencia relativa del 45 % en el grupo de intervención. Para tener en cuenta los posibles abandonos/excluidos debido a la configuración algo invasiva, incluiremos un total de 30 pacientes (15 por grupo).

Reclutamiento: Los sujetos serán reclutados a través de forsøgsperson.dk o sitios similares junto con publicidad en sitios relevantes.

Los sujetos se comunicarán con nosotros en CFAS y se les dará la opción de recibir información del estudio pr. teléfono (lo que niega la opción de un espectador) o una reunión cara a cara en CFAS. Toda esta información será dada por el investigador principal. Si el sujeto está interesado en escuchar más sobre el estudio, se le enviarán por correo electrónico los documentos pertinentes. Si el sujeto está interesado en unirse al estudio después de haber recibido información escrita u oral, tendrá 24 horas para considerar la participación en el estudio. Cuando el sujeto haya sido informado ya sea por teléfono o personalmente y acepte participar en el estudio, se le invitará a la visita 1 donde se obtendrá el consentimiento informado por escrito (o firmado y traído de casa por el participante).

Riesgos y reacciones adversas: Los sujetos pueden experimentar molestias leves con respecto a las muestras de sangre y tejido. El volumen de sangre extraído es insignificante y no se asociará con ningún riesgo para la salud. Todas las muestras de tejidos se realizarán en condiciones estériles durante la anestesia local y, por lo tanto, se asociarán con poco dolor o incomodidad y muy poco riesgo de infección. Durante la prueba de ejercicio, los participantes pueden experimentar dificultad para respirar.

La inhibición de IL-6R generalmente se tolera bien con solo algunos efectos secundarios. La dosis de paracetamol es baja y no se asocia a ningún riesgo.

La información de contacto del médico involucrado se proporcionará a los participantes en el momento de la inclusión en el estudio, de modo que cualquier evento adverso pueda ser informado y resuelto.

Difusión de los resultados del estudio: tanto los resultados positivos como los negativos y los no concluyentes se publicarán en revistas científicas internacionales relevantes.

Consideración ética: Se espera que el proyecto cause riesgos, efectos secundarios e incomodidad limitados. Todos los procedimientos serán realizados por médicos y fisiólogos experimentados con la seguridad pertinente. Tocilizumab es generalmente bien tolerado y la dosis de paracetamol es baja. Los sujetos incluidos podrán en cualquier momento, y sin justificación, retractarse de su consentimiento de participación en el estudio. Creemos que el proyecto es importante y contribuirá con nueva información crítica sobre la respuesta de las células NK modificables por IL-6 al ejercicio agudo tanto en la circulación como en el tejido adiposo y muscular (ya que actualmente hay un conocimiento muy limitado sobre este último).

El estudio se considera un estudio de caja de herramientas de Lægemiddelstyrelsen y, por lo tanto, no es un estudio farmacéutico.