Prognostická hodnota exprese proteinu IMP3 u rakoviny děložního čípku

Molekulární biomarkery by mohly selektivně identifikovat pacienty s nepříznivějším klinickým průběhem. Jedním z těchto biomarkerů je IMP3 - protein vázající mRNA inzulinu podobný růstový faktor II.

Skupina IGF je komplexní regulační síť na buněčné a podstatné úrovni a hraje klíčovou fyziologickou roli ve vývoji organismu a udržování normální buněčné funkce během fetálního a postnatálního života. Nadměrná exprese růstových faktorů a jejich receptorů je běžným jevem během karcinogeneze. Signální systém IGF je pod přísnou kontrolou normálního fyziologického stavu a odchylka v této křehké rovnováze může být spouštěčem mnoha molekulárních událostí vedoucích k rozvoji malignity. Jedním členem systému IGF je protein vázající mRNA inzulínu podobný růstový faktor II (IMP), o kterém bylo zjištěno, že je aktivátorem translační mRNA IGF-II, čímž získává dominantní roli při kontrole buněčné proliferace závislé na IGF-II.

Rodina proteinů IMP obsahuje 3 proteiny (IMP1, IMP2, IMP3). IMP3 je normálně exprimován ve fetálních tkáních během embryogeneze. V dospělosti se objevuje jako onkoprotein, který je exprimován pouze v nádorových tkáních bez přítomnosti v okolní (přilehlé) benigní tkáni. Předchozí studie in vitro ukázaly, že IMP3 stimuluje proliferaci nádorových buněk aktivací translace a adheze a invaze IGF II prostřednictvím adhezních molekul a matricových metaloproteináz 1.

Výsledky nedávného výzkumu rakoviny děložního čípku a jejích prekancerózních lézí spojily expresi proteinu IMP3 s cervikální dysplazií a možností těžké cervikální dysplazie (CIN III) progredující do spinocelulárního karcinomu. Vyšší exprese proteinu IMP3 byla nalezena v cytoplazmách buněk těžké cervikální dysplazie (CIN III) a invazivních nádorových buněk ve srovnání s buňkami změn CIN I a CIN II. Senzitivita exprese IMP3 v nádorových buňkách byla 96 %. V preparátech, které byly IMP3 negativní, žádné další sledování a léčba neodhalily spinocelulární karcinom. Další analýzy naznačily možnost stanovení exprese IMP3 na prvních vzorcích z cervikální biopsie u pacientů s lézemi HSIL jako biomarker pro detekci podskupiny pacientů, u kterých lze očekávat invazivitu lézí.

Na základě předchozích studií byla vyvinuta monoklonální protilátka specifická pro IMP3, která se úspěšně používá v rutinních imunohistochemických metodách, které studují expresi proteinů IMP3 u různých malignit. Nedávno bylo zjištěno, že exprese proteinu IMP3 je spojena s agresivnějším klinickým průběhem a méně příznivým výsledkem jak u gynekologických, tak u maligních onemocnění jiných orgánových systémů.

Problémy výzkumu

Navzdory předchozím znalostem prevence, detekce a léčby způsobuje rakovina děložního čípku stále velké bolesti a mortalitu. Klinický průběh byl dosud s ohledem na klinické a patologické stadium onemocnění přehlížen a na základě histologických parametrů a anatomického rozsahu onemocnění bylo rozhodnuto o další léčbě a prognóze onemocnění.

Předchozí výzkum poskytl pouze úvod do spojení exprese proteinu IMP3 s rakovinou děložního čípku. Byla nalezena souvislost mezi zvýšenou expresí proteinu IMP3 u gynekologických a jiných rakovin v těle s horším výsledkem onemocnění.

Tato studie by se zabývala expresí proteinu IMP3 u spinocelulárního karcinomu děložního čípku s cílem detekovat a spojit zvýšenou expresi proteinu IMP3 u pacientů, u kterých se očekává nepříznivý klinický průběh a horší prognóza. Budou pozorováni pouze pacienti ve stádiích onemocnění FIGO 1A1 a 1B1, což v předchozích studiích nebylo provedeno. Tímto způsobem by byli vyčleněni pacienti, kteří by byli léčeni chirurgicky, u kterých by bylo možné předvídat horší klinický výsledek a individuálně naplánovat další léčbu.

Účel výzkumu

Studie určí význam imunohistochemické exprese proteinu IMP3 u spinocelulárního karcinomu děložního čípku jako prognostického faktoru spojeného s vyšším histologickým stupněm nádoru, vyšším stadiu FIGO, horším průběhem a výsledkem onemocnění.

Výzkumná hypotéza

Imunohistochemická exprese proteinu IMP3 u spinocelulárního karcinomu děložního čípku byla spojena s horším klinickým průběhem a výsledkem onemocnění, kratším trváním intervalu bez onemocnění a horšími výsledky 5letého přežití.

Imunohistochemické stanovení exprese proteinu IMP3 u karcinomu děložního čípku - jako nový prognostický faktor

Z výzkumu budou vyloučeni:

• pacientů, kteří podstoupili předoperační chemoterapii a/nebo radioterapii
• pacientky s přidruženými gynekologickými nebo jinými malignitami
• pacienti s jinými histologickými typy nádorů (adenokarcinom, adenoskvamózní, neuroendokrinní atd.) Výzkum bude prováděn na patohistologických preparátech chirurgického materiálu pacientek operovaných pro karcinom děložního hrdla v SKB Mostar ve výše uvedeném období.

Exprese proteinu IMP3 bude stanovena imunohistochemickou metodou a statistická analýza bude použita k posouzení asociace exprese s klinickou a patologickou progresí onemocnění a parametry přežití.

Nahlédnutí do zdravotnické dokumentace (anamnéza pacientů a lékařská dokumentace onkologických pacientů z Kliniky onkologie a gynekologie SKB Mostar) poskytne klinická data o věku pacientů, klinickém stadiu onemocnění stanoveném podle FIGO klasifikačních kritérií, recidivě/délce onemocnění. období bez známek onemocnění a klinického výsledku.

Metody výzkumu:

Vzorky nádoru pro analýzu budou získány 4μ řezy archivovaných parafínových bloků.

Pro imunohistochemickou analýzu budou použity myší monoklonální antihumánní protilátky IMP3 (DAKO) v ředění 1:100.

Imunohistochemický proces začne odparafinováním tkáně nejprve v xylenu a poté rehydratací v alkoholech stále nižších koncentrací. Inkubace v 0,1% H2O2 (30 minut při pokojové teplotě) inaktivovala endogenní peroxidázu. Za účelem detekce antigenních míst se řezy povaří v citrátovém pufru, pH 9, v mikrovlnné troubě při 95 °C po dobu 10 minut, poté se promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Po ochlazení na teplotu místnosti byly řezy inkubovány s primárními protilátkami po dobu 60 minut. Po jedné hodině inkubace s primární protilátkou a promytí v PBS bude použita sekundární detekce diaminobenzidinem (DAB). K tomuto účelu bude použita na protilátkách nezávislá EnVision Detection Systems Peroxidase (DAB, Rabbit / Mouse K 5007). Po 30 minutách inkubace a promytí v PBS budou řezy barveny diaminobenzidinem (DAB) po dobu 10 minut při teplotě místnosti a promyty v destilované vodě a obarveny hemalaunem. Řezy se poté zasadí do montážního média a zakryjí krycími sklíčky. Buňky, které reagovaly s vhodnými primárními protilátkami, by měly mít obarvené cytoplazmy.

Výsledky imunohistochemického barvení budou interpretovány semikvantitativně. Vzorky s cytoplazmatickým barvením ve více než 10 % nádorových buněk budou považovány za pozitivní expresi a budou klasifikovány do 5 kategorií: 0 (1 % -10 % obarvených buněk), 1 (11 % -25 %), 2 ( 26 % 50) %), 3 (51 % -75 %) a 4 (76 % -100 %). Intenzita exprese IMP3 bude klasifikována jako negativní, slabá, střední nebo závažná.

Řezy určené pro negativní kontrolu imunohistochemickým barvením každého antigenu budou spolu s ostatními řezy podrobeny stejnému postupu, kromě toho, že nebudou inkubovány s primární protilátkou, ale budou po tuto dobu v PBS. Kontrolní sklíčka od výrobce budou použita jako pozitivní kontrola.

Vzorky budou zkoumány světelným mikroskopem Olympus BX40 (Olympus, Tokio, Japonsko).

Celkové přežití pacientky (OS) bylo definováno jako časové období mezi datem operace a datem poslední klinické kontroly nebo úmrtím na rakovinu děložního čípku.

Disease-free interval (DFS) je definován jako časový interval mezi datem operace a datem recidivy onemocnění.

Statistické zpracování dat:

Získané výsledky výzkumu budou uloženy v databázi MS Excel 2007, pro všechny statistické analýzy bude použit statistický program SPSS 17. V analýze dat budou použity metody deskriptivní statistiky. Neparametrické proměnné budou zobrazeny jako frekvence a procenta. V závislosti na distribuci dat se parametrické proměnné zobrazí jako aritmetický průměr a směrodatná odchylka nebo jako medián a mezikvartilové rozmezí. Distribuce dat bude testována Kolmogorovovým-Smirnovovým testem. K testování rozdílů mezi skupinami u kategoriálních proměnných bude v případě potřeby použit chí-kvadrát test a Fisherův exaktní test. K testování rozdílu mezi parametrickými proměnnými bude jako neparametrické alternativy použit Studentský t-test a jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) nebo Mann-Whitney U test a Kruskal-Wallisův test jako neparametrické alternativy v případě, že se rozložení dat odchyluje od normálu. K testování korelace mezi zkoumanými proměnnými budou použity vhodné korelační a regresní testy. Při analýze přežití a recidivy onemocnění bude v závislosti na získaných datech použita Kaplan-Meierova metoda a Cox-Mantelův log-rank test nebo Mantel-Haenszelův test. Úroveň pravděpodobnosti p < 0,005 bude brána jako statisticky významná.