Prognostischer Wert der Protein-IMP3-Expression bei Gebärmutterhalskrebs

Molekulare Biomarker könnten selektiv Patienten mit einem ungünstigeren klinischen Verlauf identifizieren. Einer dieser Biomarker ist IMP3 – das mRNA-bindende Protein des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors II.

Die IGF-Gruppe ist ein komplexes regulatorisches Netzwerk auf zellulärer und substantieller Ebene und spielt eine wichtige physiologische Rolle bei der Entwicklung des Organismus und der Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktion während des fetalen und postnatalen Lebens. Eine Überexpression von Wachstumsfaktoren und ihren Rezeptoren ist ein häufiges Ereignis bei der Krebsentstehung. Das IGF-Signalsystem steht unter strenger Kontrolle des normalen physiologischen Zustands und eine Abweichung in diesem empfindlichen Gleichgewicht kann ein Auslöser für viele molekulare Ereignisse sein, die zur Entwicklung einer malignen Erkrankung führen. Ein Mitglied des IGF-Systems ist das insulinähnliche Wachstumsfaktor-II-mRNA-Bindungsprotein (IMP), das sich als Aktivator der IGF-II-Translations-mRNA erwiesen hat und somit eine dominante Rolle bei der Kontrolle der IGF-II-abhängigen Zellproliferation spielt.

Die IMP-Proteinfamilie enthält 3 Proteine ​​(IMP1, IMP2, IMP3). IMP3 wird normalerweise während der Embryogenese im fetalen Gewebe exprimiert. Im Erwachsenenalter erscheint es als Onkoprotein, das nur in Tumorgeweben exprimiert wird, ohne dass es im umgebenden (angrenzenden) gutartigen Gewebe vorhanden ist. Frühere In-vitro-Studien haben gezeigt, dass IMP3 die Tumorzellproliferation stimuliert, indem es die IGF II-Translation und -Adhäsion sowie die Invasion über Adhäsionsmoleküle und Matrix-Metalloproteinasen aktiviert 1.

Die Ergebnisse der jüngsten Forschung zu Gebärmutterhalskrebs und seinen präkanzerösen Läsionen haben die Expression des IMP3-Proteins mit zervikaler Dysplasie und der Möglichkeit einer schweren zervikalen Dysplasie (CIN III) in Verbindung gebracht, die sich zu Plattenepithelkarzinomen entwickelt. Im Zytoplasma von Zellen mit schwerer zervikaler Dysplasie (CIN III) und invasiven Tumorzellen wurde im Vergleich zu CIN I- und CIN II-Veränderungszellen eine höhere Expression des IMP3-Proteins gefunden. Die Sensitivität der IMP3-Expression in Tumorzellen betrug 96 %. Bei Präparaten, die IMP3-negativ waren, ergab keine weitere Überwachung und Behandlung ein Plattenepithelkarzinom. Weitere Analysen deuteten auf die Möglichkeit hin, die IMP3-Expression in ersten Biopsieproben des Gebärmutterhalses bei Patienten mit HSIL-Läsionen als Biomarker zu bestimmen, um eine Untergruppe von Patienten zu erkennen, bei denen eine Läsionsinvasivität zu erwarten ist.

Basierend auf früheren Studien wurde ein für IMP3 spezifischer monoklonaler Antikörper entwickelt, der erfolgreich in routinemäßigen immunhistochemischen Methoden eingesetzt wird, die die Expression von IMP3-Proteinen bei verschiedenen bösartigen Erkrankungen untersuchen. Kürzlich wurde festgestellt, dass die Expression des IMP3-Proteins mit einem aggressiveren klinischen Verlauf und einem ungünstigeren Ausgang sowohl bei gynäkologischen als auch bei bösartigen Erkrankungen anderer Organsysteme verbunden ist.

Forschungsfragen

Trotz bisheriger Erkenntnisse zur Prävention, Erkennung und Behandlung ist Gebärmutterhalskrebs immer noch mit großen Schmerzen und einer hohen Sterblichkeit verbunden. Der klinische Verlauf wurde bislang hinsichtlich des klinischen und pathologischen Krankheitsstadiums außer Acht gelassen und anhand histologischer Parameter und anatomischer Ausmaße der Erkrankung eine Entscheidung über die weitere Behandlung und Prognose der Erkrankung getroffen.

Frühere Forschungsarbeiten lieferten lediglich eine Einführung in den Zusammenhang der IMP3-Proteinexpression mit Gebärmutterhalskrebs. Es wurde ein Zusammenhang zwischen der erhöhten Expression des IMP3-Proteins bei gynäkologischen und anderen Krebsarten im Körper und einem schlechteren Krankheitsverlauf festgestellt.

Diese Studie würde die Expression des IMP3-Proteins bei Plattenepithelkarzinomen des Gebärmutterhalses untersuchen, mit dem Ziel, die erhöhte Expression des IMP3-Proteins bei Patienten zu erkennen und zu verknüpfen, bei denen ein ungünstiger klinischer Verlauf und eine schlechtere Prognose zu erwarten sind. Es werden nur Patienten in den Krankheitsstadien FIGO 1A1 und 1B1 beobachtet, was in früheren Studien nicht geschehen ist. Auf diese Weise könnten Patienten ausgewählt werden, die operativ behandelt werden müssten, bei denen ein schlechteres klinisches Ergebnis vorhergesagt werden könnte und eine zusätzliche Behandlung individuell geplant werden könnte.

Zweck der Forschung

Die Studie wird die Bedeutung der immunhistochemischen Expression des IMP3-Proteins beim Plattenepithelkarzinom des Gebärmutterhalses als prognostischen Faktor ermitteln, der mit einem höheren histologischen Grad des Tumors, einem höheren FIGO-Stadium, einem schlechteren Verlauf und einem schlechteren Krankheitsverlauf verbunden ist.

Forschungshypothese

Die immunhistochemische Expression des IMP3-Proteins bei Plattenepithelkarzinomen des Gebärmutterhalses war mit einem schlechteren klinischen Verlauf und Krankheitsausgang, einer kürzeren krankheitsfreien Intervalldauer und schlechteren 5-Jahres-Überlebensergebnissen verbunden.

Immunhistochemische Bestimmung der IMP3-Proteinexpression bei Gebärmutterhalskrebs – als neuer Prognosefaktor

Folgendes wird von der Forschung ausgeschlossen:

• Patienten, die sich einer präoperativen Chemo- und/oder Strahlentherapie unterzogen haben
• Patienten mit assoziierten gynäkologischen oder anderen bösartigen Erkrankungen
• Patienten mit anderen histologischen Tumorarten (Adenokarzinom, adenosquamöses, neuroendokrines usw.) Die Forschung wird an pathohistologischen Präparaten von chirurgischem Material von Patienten durchgeführt, die im oben genannten Zeitraum in der SKB Mostar wegen Gebärmutterhalskrebs operiert wurden.

Die Expression des IMP3-Proteins wird durch immunhistochemische Methoden bestimmt und statistische Analysen werden verwendet, um den Zusammenhang der Expression mit klinischen und pathologischen Krankheitsverlaufs- und Überlebensparametern zu bewerten.

Ein Einblick in die medizinische Dokumentation (Patientengeschichten und medizinische Dokumentation von Onkologiepatienten aus der Abteilung für Onkologie und Gynäkologie der Klinik SKB Mostar) liefert klinische Daten zum Alter der Patienten, zum klinischen Stadium der Krankheit, bestimmt durch FIGO-Klassifizierungskriterien, zum Wiederauftreten/zur Dauer von Zeitraum ohne Anzeichen einer Krankheit und ohne klinisches Ergebnis.

Forschungsmethoden:

Tumorproben zur Analyse werden aus 4μ-Schnitten archivierter Paraffinblöcke entnommen.

Für die immunhistochemische Analyse werden monoklonale antihumane Mausantikörper und IMP3 (DAKO) in einer Verdünnung von 1:100 verwendet.

Der immunhistochemische Prozess beginnt mit der Entparaffinierung des Gewebes zunächst in Xylol und der anschließenden Rehydratisierung in Alkoholen immer geringerer Konzentration. Inkubation in 0,1 % H2O2 (30 Minuten bei Raumtemperatur) inaktivierte endogene Peroxidase. Um Antigenstellen nachzuweisen, werden die Schnitte 10 Minuten lang in Citratpuffer, pH 9, in einem Mikrowellenofen bei 95 °C gekocht und dann in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Schnitte 60 Minuten lang mit Primärantikörpern inkubiert. Nach einer Stunde Inkubation mit dem primären Antikörper und Waschen in PBS erfolgt der sekundäre Nachweis mit Diaminobenzidin (DAB). Zu diesem Zweck wird eine antikörperunabhängige EnVision Detection Systems Peroxidase (DAB, Rabbit/Mouse K 5007) verwendet. Nach 30-minütiger Inkubation und Waschen in PBS werden die Schnitte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Diaminobenzidin (DAB) gefärbt, in destilliertem Wasser gewaschen und mit Hemalaun gefärbt. Anschließend werden die Einschnitte in das passende Medium eingepasst und mit Deckgläsern abgedeckt. Zellen, die mit den entsprechenden Primärantikörpern reagierten, sollten gefärbte Zytoplasmen aufweisen.

Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung werden semiquantitativ interpretiert. Proben mit zytoplasmatischer Färbung in mehr als 10 % der Tumorzellen werden als positive Expression betrachtet und in 5 Kategorien eingeteilt: 0 (1 % – 10 % der gefärbten Zellen), 1 (11 % – 25 %), 2 ( 26 % 50 %), 3 (51 % – 75 %) und 4 (76 % – 100 %). Die Intensität der IMP3-Expression wird als negativ, schwach, mittelschwer oder schwer eingestuft.

Schnitte, die zur Negativkontrolle durch immunhistochemische Färbung jedes Antigens vorgesehen sind, werden zusammen mit anderen Schnitten dem gleichen Verfahren unterzogen, mit der Ausnahme, dass sie nicht mit dem primären Antikörper inkubieren, sondern sich während dieser Zeit in PBS befinden. Als Positivkontrolle werden Kontrollobjektträger des Herstellers verwendet.

Die Proben werden mit einem Olympus BX40-Lichtmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) untersucht.

Das Gesamtüberleben des Patienten (OS) wurde als der Zeitraum zwischen dem Datum der Operation und dem Datum der letzten klinischen Kontrolle oder dem Tod durch Gebärmutterhalskrebs definiert.

Das krankheitsfreie Intervall (DFS) ist definiert als die Zeitspanne zwischen dem Datum der Operation und dem Datum des Wiederauftretens der Krankheit.

Statistische Datenverarbeitung:

Die erhaltenen Forschungsergebnisse werden in der Datenbank MS Excel 2007 gespeichert, für alle statistischen Analysen wird das Statistikprogramm SPSS 17 verwendet. Bei der Datenanalyse kommen Methoden der deskriptiven Statistik zum Einsatz. Nichtparametrische Variablen werden als Häufigkeit und Prozentsatz angezeigt. Abhängig von der Datenverteilung werden die parametrischen Variablen als arithmetisches Mittel und Standardabweichung oder als Median und Interquartilbereich angezeigt. Die Datenverteilung wird mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test getestet. Bei Bedarf werden ein Chi-Quadrat-Test und der exakte Fisher-Test verwendet, um Unterschiede zwischen Gruppen für kategoriale Variablen zu testen. Der Student-T-Test und die einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) oder der Mann-Whitney-U-Test und der Kruskal-Wallis-Test als nichtparametrische Alternativen für den Fall, dass die Datenverteilung von der Normalverteilung abweicht, werden verwendet, um den Unterschied zwischen parametrischen Variablen zu testen. Um die Korrelation zwischen den untersuchten Variablen zu testen, werden entsprechende Korrelations- und Regressionstests eingesetzt. Bei der Analyse des Überlebens und des Wiederauftretens der Erkrankung werden je nach gewonnenen Daten die Kaplan-Meier-Methode und der Cox-Mantel-Log-Rank-Test oder der Mantel-Haenszel-Test verwendet. Das Wahrscheinlichkeitsniveau von p <0,005 wird als statistisch signifikant angesehen.