Wartość prognostyczna ekspresji białka IMP3 w raku szyjki macicy

Biomarkery molekularne mogłyby selektywnie identyfikować pacjentów z bardziej niekorzystnym przebiegiem klinicznym. Jednym z takich biomarkerów jest IMP3 - białko wiążące mRNA insulinopodobnego czynnika wzrostu II.

Grupa IGF jest złożoną siecią regulatorową na poziomie komórkowym i substancjalnym i odgrywa kluczową fizjologiczną rolę w rozwoju organizmu i utrzymaniu prawidłowych funkcji komórkowych w życiu płodowym i pourodzeniowym. Nadekspresja czynników wzrostu i ich receptorów jest częstym zjawiskiem podczas kancerogenezy. System sygnalizacji IGF znajduje się pod ścisłą kontrolą normalnego stanu fizjologicznego, a odchylenie w tej delikatnej równowadze może być wyzwalaczem wielu zdarzeń molekularnych prowadzących do rozwoju nowotworu. Jednym z członków systemu IGF jest białko wiążące mRNA insulinopodobnego czynnika wzrostu II (IMP), które, jak stwierdzono, jest aktywatorem mRNA translacji IGF-II, zyskując w ten sposób dominującą rolę w kontrolowaniu zależnej od IGF-II proliferacji komórek.

Rodzina białek IMP obejmuje 3 białka (IMP1, IMP2, IMP3). IMP3 jest normalnie wyrażany w tkankach płodu podczas embriogenezy. W wieku dorosłym pojawia się jako onkoproteina, która ulega ekspresji tylko w tkankach nowotworowych, bez obecności w otaczającej (sąsiedniej) łagodnej tkance. Poprzednie badania in vitro wykazały, że IMP3 stymuluje proliferację komórek nowotworowych poprzez aktywację translacji i adhezji IGF II oraz inwazji poprzez cząsteczki adhezyjne i metaloproteinazy macierzy 1.

Wyniki ostatnich badań nad rakiem szyjki macicy i jego zmianami przedrakowymi powiązały ekspresję białka IMP3 z dysplazją szyjki macicy i możliwością progresji ciężkiej dysplazji szyjki macicy (CIN III) do raka płaskonabłonkowego. Wyższą ekspresję białka IMP3 stwierdzono w cytoplazmie komórek ciężkiej dysplazji szyjki macicy (CIN III) i inwazyjnych komórek nowotworowych w porównaniu z komórkami CIN I i CIN II zmiany. Czułość ekspresji IMP3 w komórkach nowotworowych wynosiła 96%. W preparatach, które były IMP3-ujemne, dalsze monitorowanie i leczenie nie ujawniło raka płaskonabłonkowego. Dalsze analizy wykazały możliwość oznaczenia ekspresji IMP3 na wycinkach z pierwszej biopsji szyjki macicy u pacjentek ze zmianami HSIL jako biomarkera do wykrywania podgrupy pacjentek, u których można spodziewać się inwazyjności zmiany.

Na podstawie wcześniejszych badań opracowano przeciwciało monoklonalne specyficzne dla IMP3, które jest z powodzeniem stosowane w rutynowych metodach immunohistochemicznych, które badają ekspresję białek IMP3 w różnych nowotworach. Ostatnio stwierdzono, że ekspresja białka IMP3 wiąże się z bardziej agresywnym przebiegiem klinicznym i mniej korzystnym rokowaniem zarówno w chorobach ginekologicznych, jak i nowotworowych innych układów narządów.

Kwestie badawcze

Pomimo wcześniejszej wiedzy na temat profilaktyki, wykrywania i leczenia, rak szyjki macicy nadal powoduje ogromny ból i śmiertelność. Dotychczas pomijano przebieg kliniczny w odniesieniu do klinicznego i patologicznego zaawansowania choroby i na podstawie parametrów histologicznych oraz anatomicznego zaawansowania choroby podjęto decyzję o dalszym leczeniu i rokowaniu choroby.

Poprzednie badania dostarczyły jedynie wstępu do związku ekspresji białka IMP3 z rakiem szyjki macicy. Stwierdzono związek między zwiększoną ekspresją białka IMP3 w nowotworach ginekologicznych i innych nowotworach organizmu z gorszym przebiegiem choroby.

Badanie to dotyczyłoby ekspresji białka IMP3 w raku płaskonabłonkowym szyjki macicy w celu wykrycia i powiązania zwiększonej ekspresji białka IMP3 u pacjentów, u których oczekuje się niekorzystnego przebiegu klinicznego i gorszego rokowania. Obserwowani będą tylko pacjenci w stadiach choroby FIGO 1A1 i 1B1, czego nie robiono we wcześniejszych badaniach. W ten sposób wyodrębnieni byliby pacjenci, którzy mieliby być leczeni operacyjnie, u których można było przewidzieć gorszy wynik kliniczny i indywidualnie zaplanować dodatkowe leczenie.

Cel badań

Celem badań będzie określenie znaczenia immunohistochemicznej ekspresji białka IMP3 w raku płaskonabłonkowym szyjki macicy jako czynnika prognostycznego związanego z wyższym stopniem złośliwości histologicznej guza, wyższym stopniem zaawansowania FIGO, gorszym przebiegiem i rokowaniem choroby.

Hipoteza badawcza

Immunohistochemiczna ekspresja białka IMP3 w raku płaskonabłonkowym szyjki macicy wiązała się z gorszym przebiegiem klinicznym i rokowaniem choroby, krótszym okresem wolnym od choroby i gorszymi wynikami przeżycia 5-letniego.

Immunohistochemiczne oznaczanie ekspresji białka IMP3 w raku szyjki macicy – ​​jako nowy czynnik prognostyczny

Z badania zostaną wykluczeni:

• pacjenci, którzy przeszli przedoperacyjną chemioterapię i/lub radioterapię
• pacjentki ze współistniejącymi nowotworami ginekologicznymi lub innymi nowotworami złośliwymi
• pacjenci z innymi typami histologicznymi nowotworów (gruczolakorak, gruczolakołuskowaty, neuroendokrynny itp.) Badania będą prowadzone na preparatach patohistologicznych materiału chirurgicznego pacjentek operowanych z powodu raka szyjki macicy w SKB Mostar w powyższym okresie.

Ekspresja białka IMP3 zostanie określona metodą immunohistochemiczną, a analiza statystyczna zostanie wykorzystana do oceny związku ekspresji z klinicznymi i patologicznymi parametrami postępu choroby i przeżycia.

Wgląd w dokumentację medyczną (historie medyczne pacjentów i dokumentację medyczną pacjentów onkologicznych z Oddziału Onkologii i Ginekologii Kliniki SKB Mostar) dostarczy danych klinicznych dotyczących wieku pacjentów, stopnia zaawansowania klinicznego choroby określonego przez kryteria klasyfikacji FIGO, nawrotów/długości okres bez objawów choroby i wyniku klinicznego.

Metody badawcze:

Próbki guza do analizy zostaną pobrane z 4 μ skrawków zarchiwizowanych bloczków parafinowych.

Mysie przeciwciała monoklonalne antyludzkie IMP3 (DAKO) w rozcieńczeniu 1:100 zostaną użyte do analizy immunohistochemicznej.

Proces immunohistochemiczny rozpocznie się od woskowania tkanki najpierw w ksylenie, a następnie ponownego uwodnienia w alkoholach o coraz niższych stężeniach. Inkubacja w 0,1% H2O2 (30 minut w temperaturze pokojowej) inaktywowała endogenną peroksydazę. W celu wykrycia miejsc antygenowych skrawki będą gotowane w buforze cytrynianowym, pH 9, w kuchence mikrofalowej w temperaturze 95°C przez 10 minut, a następnie płukane w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej skrawki inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 60 minut. Po jednej godzinie inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym i przemyciu w PBS, zostanie zastosowana detekcja wtórna diaminobenzydyną (DAB). W tym celu zostanie wykorzystana niezależna od przeciwciał peroksydaza EnVision Detection Systems (DAB, Rabbit / Mouse K 5007). Po 30-minutowej inkubacji i przemyciu w PBS skrawki będą barwione diaminobenzydyną (DAB) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, przemywane wodą destylowaną i barwione hemalaunem. Nacięcia zostaną następnie dopasowane do środka dopasowującego i przykryte szkiełkami nakrywkowymi. Komórki, które zareagowały z odpowiednimi pierwszorzędowymi przeciwciałami, powinny mieć wybarwioną cytoplazmę.

Wyniki barwienia immunohistochemicznego będą interpretowane półilościowo. Próbki z wybarwieniem cytoplazmatycznym w ponad 10% komórek nowotworowych zostaną uznane za dodatnie i zostaną sklasyfikowane w 5 kategoriach: 0 (1% -10% wybarwionych komórek), 1 (11% -25%), 2 ( 26% 50) %), 3 (51% -75%) i 4 (76% -100%). Intensywność ekspresji IMP3 zostanie sklasyfikowana jako ujemna, słaba, umiarkowana lub ciężka.

Skrawki przeznaczone do kontroli negatywnej przez barwienie immunohistochemiczne każdego antygenu zostaną poddane, wraz z innymi skrawkami, tej samej procedurze, z wyjątkiem tego, że nie będą one inkubowane z przeciwciałem pierwszorzędowym, ale będą w tym czasie przebywać w PBS. Szkiełka kontrolne producenta zostaną użyte jako kontrola pozytywna.

Próbki zostaną zbadane za pomocą mikroskopu świetlnego Olympus BX40 (Olympus, Tokio, Japonia).

Całkowite przeżycie pacjentki (OS) zdefiniowano jako okres między datą operacji a datą ostatniej kontroli klinicznej lub zgonu z powodu raka szyjki macicy.

Okres wolny od choroby (DFS) definiuje się jako odstęp czasu między datą operacji a datą nawrotu choroby.

Przetwarzanie danych statystycznych:

Uzyskane wyniki badań zostaną zapisane w bazie danych MS Excel 2007, do wszystkich analiz statystycznych wykorzystywany będzie program statystyczny SPSS 17. W analizie danych zostaną wykorzystane metody statystyki opisowej. Zmienne nieparametryczne będą wyświetlane jako częstość i procent. W zależności od rozkładu danych, zmienne parametryczne będą wyświetlane jako średnia arytmetyczna i odchylenie standardowe lub jako mediana i rozstęp międzykwartylowy. Rozkład danych zostanie przetestowany testem Kołmogorowa-Smirnowa. Test chi-kwadrat i dokładny test Fishera zostaną użyte do sprawdzenia różnic między grupami dla zmiennych jakościowych, jeśli to konieczne. Test t-Studenta i jednokierunkowa analiza wariancji (ANOVA) lub test U Manna-Whitneya i test Kruskala-Wallisa jako nieparametryczne alternatywy w przypadku, gdy rozkład danych odbiega od normalnego, zostaną użyte do przetestowania różnicy między zmiennymi parametrycznymi. Do zbadania korelacji między badanymi zmiennymi zostaną zastosowane odpowiednie testy korelacji i regresji. W analizie przeżycia i nawrotu choroby, w zależności od uzyskanych danych, wykorzystana zostanie metoda Kaplana-Meiera oraz test log-rank Coxa-Mantela lub test Mantela-Haenszela. Poziom prawdopodobieństwa p <0,005 zostanie przyjęty jako istotny statystycznie.