Valor Prognóstico da Expressão da Proteína IMP3 no Câncer Cervical

Biomarcadores moleculares poderiam identificar seletivamente pacientes com um curso clínico mais desfavorável. Um desses biomarcadores é o IMP3 - proteína de ligação do mRNA do fator de crescimento semelhante à insulina II.

O grupo IGF é uma rede regulatória complexa nos níveis celular e substancial e desempenha um papel fisiológico fundamental no desenvolvimento do organismo e na manutenção da função celular normal durante a vida fetal e pós-natal. A superexpressão de fatores de crescimento e seus receptores é um evento comum durante a carcinogênese. O sistema de sinalização do IGF está sob controle estrito do estado fisiológico normal e um desvio nesse delicado equilíbrio pode desencadear muitos eventos moleculares que levam ao desenvolvimento de malignidade. Um membro do sistema IGF é a proteína de ligação do mRNA (IMP) do fator de crescimento II semelhante à insulina, que se descobriu ser um ativador da tradução do mRNA do IGF-II, ganhando assim um papel dominante no controle da proliferação celular dependente do IGF-II.

A família de proteínas IMP contém 3 proteínas (IMP1, IMP2, IMP3). O IMP3 é normalmente expresso em tecidos fetais durante a embriogênese. Na idade adulta, aparece como uma oncoproteína que se expressa apenas nos tecidos tumorais sem a presença no tecido benigno circundante (adjacente). Estudos in vitro anteriores mostraram que o IMP3 estimula a proliferação de células tumorais ativando a tradução e adesão e invasão do IGF II via moléculas de adesão e metaloproteinases de matriz 1.

Os resultados de pesquisas recentes sobre câncer cervical e suas lesões pré-cancerosas vincularam a expressão da proteína IMP3 à displasia cervical e à possibilidade de displasia cervical grave (CIN III) progredir para carcinoma de células escamosas. Uma maior expressão da proteína IMP3 foi encontrada nos citoplasmas de células com displasia cervical grave (NIC III) e células tumorais invasivas em comparação com células alteradas de NIC I e NIC II. A sensibilidade da expressão de IMP3 em células tumorais foi de 96%. Nas preparações que eram negativas para IMP3, nenhum monitoramento e tratamento adicional revelou carcinoma de células escamosas. Análises posteriores indicaram a possibilidade de determinar a expressão de IMP3 nas primeiras amostras de biópsia cervical em pacientes com lesões HSIL como um biomarcador para detectar um subconjunto de pacientes nos quais a invasão da lesão pode ser esperada.

Com base em estudos anteriores, um anticorpo monoclonal específico para IMP3 foi desenvolvido e é usado com sucesso em métodos imuno-histoquímicos de rotina que estudam a expressão de proteínas IMP3 em várias malignidades. Verificou-se recentemente que a expressão da proteína IMP3 está associada a um curso clínico mais agressivo e a um resultado menos favorável em doenças ginecológicas e malignas de outros sistemas de órgãos.

Questões de pesquisa

Apesar do conhecimento prévio sobre prevenção, detecção e tratamento, o câncer do colo do útero ainda causa grande dor e mortalidade. Até agora, o curso clínico foi negligenciado em relação ao estágio clínico e patológico da doença e, com base nos parâmetros histológicos e na extensão anatômica da doença, foi tomada uma decisão sobre o tratamento e o prognóstico da doença.

Pesquisas anteriores forneceram apenas uma introdução à associação da expressão da proteína IMP3 com o câncer cervical. Foi encontrada uma associação entre o aumento da expressão da proteína IMP3 em cânceres ginecológicos e outros no corpo com um pior resultado da doença.

Este estudo examinaria a expressão da proteína IMP3 no carcinoma de células escamosas do colo do útero com o objetivo de detectar e vincular o aumento da expressão da proteína IMP3 em pacientes com expectativa de evolução clínica desfavorável e pior prognóstico. Serão observados apenas pacientes nos estágios da doença FIGO 1A1 e 1B1, o que não foi feito em estudos anteriores. Dessa forma, seriam selecionados os pacientes que seriam tratados cirurgicamente, nos quais seria possível prever pior evolução clínica e planejar tratamento adicional individualmente.

Objetivo da pesquisa

O estudo determinará a importância da expressão imuno-histoquímica da proteína IMP3 no carcinoma de células escamosas do colo do útero como um fator prognóstico associado a maior grau histológico do tumor, estágio FIGO mais elevado, pior curso e evolução da doença.

hipótese de pesquisa

A expressão imuno-histoquímica da proteína IMP3 no carcinoma de células escamosas do colo do útero foi associada a pior curso clínico e desfecho da doença, menor duração do intervalo livre de doença e piores desfechos de sobrevida em 5 anos.

Determinação imuno-histoquímica da expressão da proteína IMP3 no câncer cervical - como um novo fator prognóstico

Serão excluídos da pesquisa:

• pacientes que fizeram quimioterapia e/ou radioterapia pré-operatória
• pacientes com neoplasias ginecológicas ou outras malignidades associadas
• pacientes com outros tipos histológicos de tumores (adenocarcinoma, adenoescamoso, neuroendócrino, etc.) A pesquisa será realizada em preparações histopatológicas de material cirúrgico de pacientes operadas por câncer cervical em SKB Mostar no período acima.

A expressão da proteína IMP3 será determinada pelo método imuno-histoquímico e a análise estatística será utilizada para avaliar a associação da expressão com a evolução clínica e patológica da doença e parâmetros de sobrevida.

O conhecimento da documentação médica (históricos médicos e documentação médica de pacientes oncológicos do Departamento de Oncologia e Clínica Ginecológica SKB Mostar) fornecerá dados clínicos sobre a idade dos pacientes, estágio clínico da doença determinado pelos critérios de classificação FIGO, recorrência / duração do período sem sinais de doença e evolução clínica.

Métodos de pesquisa:

Amostras tumorais para análise serão obtidas por cortes de 4μ de blocos de parafina arquivados.

Anticorpos monoclonais de camundongos anti-humanos e IMP3 (DAKO) na diluição de 1:100 serão utilizados para análise imuno-histoquímica.

O processo imuno-histoquímico começará desparafinando o tecido primeiro em xileno e depois reidratando em álcoois de concentrações cada vez mais baixas. A incubação em H2O2 a 0,1% (30 minutos à temperatura ambiente) inativou a peroxidase endógena. Para detecção de sítios antigênicos, os cortes serão fervidos em tampão citrato, pH 9, em forno de micro-ondas a 95°C por 10 minutos, em seguida lavados em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após resfriamento à temperatura ambiente, os cortes foram incubados com anticorpos primários por 60 minutos. Após uma hora de incubação com o anticorpo primário e lavagem em PBS, será utilizada a detecção secundária com diaminobenzidina (DAB). Um anticorpo independente EnVision Detection Systems Peroxidase (DAB, Rabbit / Mouse K 5007) será usado para esta finalidade. Após 30 minutos de incubação e lavagem em PBS, os cortes serão corados com diaminobenzidina (DAB) por 10 minutos em temperatura ambiente e lavados em água destilada e corados com hemalaun. As incisões serão então encaixadas no meio de adaptação e cobertas com lamínulas. As células que reagiram com os anticorpos primários apropriados devem ter citoplasmas corados.

Os resultados da coloração imunohistoquímica serão interpretados de forma semiquantitativa. Amostras com coloração citoplasmática em mais de 10% das células tumorais serão consideradas como expressão positiva, e serão classificadas em 5 categorias: 0 (1% -10% das células coradas), 1 (11% -25%), 2 ( 26% 50) %), 3 (51% -75%) e 4 (76% -100%). A intensidade da expressão do IMP3 será classificada como negativa, fraca, moderada ou grave.

Os cortes destinados ao controle negativo por coloração imuno-histoquímica de cada antígeno serão submetidos, juntamente com os demais cortes, ao mesmo procedimento, exceto que não incubarão com o anticorpo primário, mas ficarão em PBS durante esse tempo. Lâminas de controle do fabricante serão usadas como controle positivo.

Os espécimes serão examinados com um microscópio de luz Olympus BX40 (Olympus, Tóquio, Japão).

A sobrevida total do paciente (SG) foi definida como o período de tempo entre a data da cirurgia e a data do último controle clínico ou óbito por câncer cervical.

O intervalo livre de doença (DFS) é definido como o intervalo de tempo entre a data da cirurgia e a data da recorrência da doença.

Processamento de dados estatísticos:

Os resultados da pesquisa obtidos serão armazenados no banco de dados MS Excel 2007, para todas as análises estatísticas será utilizado o programa estatístico SPSS 17. Métodos de estatística descritiva serão usados ​​na análise dos dados. As variáveis ​​não paramétricas serão exibidas como frequência e porcentagem. Dependendo da distribuição dos dados, as variáveis ​​paramétricas serão exibidas como média aritmética e desvio padrão ou como mediana e intervalo interquartílico. A distribuição dos dados será testada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Um teste qui-quadrado e o teste exato de Fisher serão usados ​​para testar diferenças entre grupos para variáveis ​​categóricas quando necessário. Teste t de Student e análise de variância (ANOVA) unidirecional ou teste U de Mann-Whitney e teste de Kruskal-Wallis como alternativas não paramétricas caso a distribuição dos dados se desvie do normal serão usados ​​para testar a diferença entre as variáveis ​​paramétricas. Testes de correlação e regressão apropriados serão utilizados para testar a correlação entre as variáveis ​​examinadas. Na análise de sobrevida e recidiva da doença, serão utilizados o método de Kaplan-Meier e o teste de log-rank de Cox-Mantel ou o teste de Mantel-Haenszel, dependendo dos dados obtidos. O nível de probabilidade de p < 0,005 será considerado estatisticamente significativo.