Mikrobiom a imunitní profilování u kojenců s alergií na kravské mléko

STUDOVAT DESIGN

Popis studia:

Tato observační studie bude zahrnovat analýzu klinických dat, vzorků stolice, moči a séra (pokud je k dispozici), které budou odebrány kojencům s podezřením nebo potvrzeným CMPA nezprostředkovaným IgE. Klinické údaje budou shromažďovány z lékařských záznamů pacientů s písemným souhlasem rodičů/pečovatelů. Špinavé a mokré pleny (vzorky stolice a moči) od kojenců s možnou ne-IgE zprostředkovanou CMPA před vyloučením mléka v době zápisu budou odebírány během akutní a zotavovací fáze podle následujícího plánu:

návštěva 1: náborový den (dva vzorky stolice při dvou po sobě jdoucích stolicích), ideálně před zavedením bezmléčné diety; návštěva 2: konec týdne 1; návštěva 3: konec týdne 4; návštěva 4: týden 5, provokace proteiny kravského mléka (CMP) (dva vzorky stolice při dvou po sobě jdoucích pohybech střev, 6 hodin až 24 hodin po provokaci); návštěva 5: do týdne po stimulaci CMP; návštěva 6: týden 6. Vzorky od kojenců s možnou ne-IgE zprostředkovanou CMPA na bezmléčné dietě při zařazení budou odebrány na začátku (2 vzorky při 2 po sobě jdoucích stolicích), v týdnu 1, týdnu 4 a týdnu 6. Pokud jsou těmto pacientům vystaveni CMP během 6 týdnů studie, budou také odebrány vzorky stolice a moči před (poslední stolice před stimulací) a po expozici CMP (dva vzorky stolice při dvou po sobě jdoucích stolicích, 6 hodin až 24 hodin po výzvě). U kojenců a zdravých účastníků CMPA zprostředkované IgE budou vzorky stolice a moči odebírány pouze ve 3 časových bodech: v den náboru, ve 4. týdnu a v 6. týdnu.

Kojenci, kteří přicházejí do primární a sekundární péče v rámci zdravotního výboru Greater Glasgow & Clyde se symptomy naznačujícími možnou CMPA nezprostředkovanou IgE, budou léčeni podle místních pokynů CMPA nezprostředkovaných IgE (pro kojence krmené umělou výživou bude hypoalergenní umělé mléko nabízené; extenzivně hydrolyzovaná (eHF) nebo aminokyselinová (AAF) formule na základě závažnosti příznaků a anamnézy, zatímco u mateřského mléka bude matce doporučeno přejít na bezmléčnou dietu). Podle místních pokynů bude po 4 týdnech eliminační diety (kravské mléko od kojence a matky, pokud jsou kojeny) kojenci s mírnou až středně závažnou CMPA nezprostředkovanou IgE nabídnuta doma pod vedením nekontrolované orální potravinové výzvy (OFC) komunitního dietologa, zatímco závažnějším případům (jako je CMPIE) bude nabídnuta OFC pod dohledem lékaře. V případě přesvědčivé anamnézy, jako je opakované vystavení inkriminované potravině vyvolávající opakované zvracení a/nebo průjem do 24 hodin, bez jakékoli jiné příčiny příznaků a absence příznaků po vyloučení kravského mléka, bude OFC vynecháno. Potvrzené případy (po pozitivní výzvě nebo přesvědčivé anamnéze) se vrátí k vylučovací dietě (hypoalergenní umělé mléko nebo kojení s bezmléčnou dietou matky) podle místních doporučení.

Bude vytvořena navazující studie, která bude sledovat subjekty během jejich dalšího vývoje ve věku 3 a 5 let, protože bude vědecky zajímavé vyhodnotit konkrétní výsledky v pozdější fázi. Informační list účastníka a formulář souhlasu proto již tuto možnost řeší a zeptají se rodičů/pečovatelů účastníků, zda rodiče/pečovatelé souhlasí s tím, aby byli v budoucnu kontaktováni. V té době bude vyžadován informovaný souhlas s účastí v následné studii.

Vysazení subjektu během studie:

Pokud se rodiče/pečovatelé účastníka rozhodnou svůj souhlas odvolat, již získané vzorky budou uchovány pro účely studie, pokud nám rodiče/pečovatelé účastníka neřeknou, abychom tak nečinili, v takovém případě budou vzorky zničeny.

Vzorky budou zlikvidovány podle zásad NHS Greater Glasgow & Clyde. Pokud rodiče/pečovatelé účastníků během studie ztratí schopnost souhlasit, účast dítěte ve studii bude zrušena a identifikovatelná data nebo vzorky shromážděné se souhlasem budou uchovány a použity pro studii. Nebudou shromažďovány žádné další údaje ani vzorky ani žádné jiné výzkumné postupy prováděné na účastníkovi nebo ve vztahu k němu.

ODBĚR VZORKŮ PRO LABORATORNÍ MĚŘENÍ

Vzorky stolice a moči:

Výzkumník bude sbírat pleny v čase a místě, které jsou vhodné pro rodiče/pečovatele účastníka, včetně nemocničního oddělení nebo kliniky nebo domova účastníka. Pokud by to rodiče/pečovatelé účastníka považovali za užitečné, zdvořilostní hovory budou uskutečněny několik dní před odběrem a několik dní před odběrem vzorků a/nebo během něj budou zaslány jemné připomínky prostřednictvím SMS, telefonu nebo e-mailu, které jim pomohou s případnými dotazy. mít. Když budou k dispozici špinavé a mokré plenky, rodiče/pečovatelé účastníka okamžitě zavolají/textovou zprávu výzkumníkovi (číslo přímé linky studie) za účelem odběru a přepravy vzorků do laboratoře; vzorek bude odebrán buď předplaceným taxíkem, nebo samotnými výzkumníky. U účastníků CMPA nezprostředkovaných IgE budou vzorky stolice a moči odebírány na začátku (návštěva 1: náborový den, dva vzorky při 2 po sobě jdoucích stolicích), 1. týden (2. návštěva, 7. den), 4. týden (3. den 28) a týden 6 (návštěva 6: den 37). Pokud se provádí OFC, budou odebrány další vzorky stolice a moči před opětovným zavedením mléka (poslední stolice před OFC), v den provokace jídlem (2 vzorky při 2 po sobě jdoucích stolicích, 6 hodin až 24 hodin po provokaci) a po potravinová výzva (do jednoho týdne po provokaci). Od IgE zprostředkované CMPA a zdravých kontrolních skupinách budou odebrány 3 vzorky stolice a moči, jeden na začátku (den náboru), jeden ve 4. týdnu (28. den) a poslední v 6. týdnu (37. den). Měli byste se pokusit naplánovat návštěvy (hodnocení) na přesné datum. Pokud to není možné, měly by být naplánovány do 48 hodin.

Analýza mikroflóry:

Bakteriální diverzita: Diverzita, bohatost a relativní hojnost všech mikrobiálních rodů bude zkoumána pomocí sekvenování nové generace genu 16S rRNA na platformě IlluminaMiSeq®. Bakteriální funkční kapacita: Sekvenování celého genomu (shotgun metagenomics) bude provedeno na platformě IlluminaHiSeq®. Shotgun metagenomics bude generovat funkční profily mikrobioty a metabolických drah mapováním nesložených čtení do databáze metabolických drah KEGG pomocí HUMAnN. Bakteriální metabolická aktivita: Metabolické fenotypování vzorků bude provedeno pomocí NMR/LC/GC-FID/MS a dalších testů, jak bylo popsáno výše. Metabolomická analýza stolice umožní korelace metabolických signatur přímo s funkčními profily a anotovanými bakteriálními abundancemi, a tedy stanovení metabolických rolí klíčových členů komunity. Markery onemocnění a imunofenotypizace: Fekální kalprotektin bude měřen ze vzorků stolice za účelem identifikace možného zánětu tlustého střeva u těchto pacientů.

Po dokončení studie budou všechny vzorky uloženy a mohou být použity k řešení stejných výzkumných otázek jako tato studie, protože vznikají nové laboratorní metody. To je zvláště důležité pro mikrobiologickou analýzu, protože nové metody nám mohou nabídnout lepší pochopení úlohy mikrobioty při zánětu střev. Povolení k uložení vzorků a použití v budoucím výzkumu bude získáno písemným souhlasem.

Vzorky krve:

Pokud jde o odběr vzorků žilní krve, bude se to týkat pouze každého kojence zařazeného do studie, který podstoupí krevní testy z klinických důvodů (není vyžadováno žádné další zavádění jehly). Vzorky krve odebrané pro klinické účely, které již nejsou potřeba (nadbytečné vzorky), budou vyžádány z hematologické laboratoře Royal Hospital for Children a přeneseny do laboratoře profesora Millinga na University of Glasgow, kde budou vzorky připraveny a uloženy pro účel této studie. Odebrané krevní vzorky budou použity k měření krevních zánětlivých a imunitních markerů a k posouzení imunofenotypu technikami, které mohou zahrnovat konvenční enzymový imunosorbentní test (ELISA), cytokinovou multiplexní analýzu, průtokovou cytometrii a analýzu genové exprese.

Zánětlivá analýza:

Různé imunitní buňky a cytokiny budou měřeny v supernatantech stolice, moči a krvi. Výzkumníci budou hledat následující cytokiny včetně následujících: Th1 cytokiny: interleukin (IL) 12, interferon gama (IFN-γ), Th2 cytokiny: IL-5, IL-13, IL-4, IL-9, Th17 cytokiny : IL17, IL22, Treg cytokiny: IL-10, transformující růstový faktor beta (TGF-β) a zánětlivé cytokiny: tumor nekrotizující faktor alfa (TNF-α), IL-1β, IL-2, IL-6 a IL- 8. Humorální imunitní odpověď bude hodnocena kvantifikací antigen-specifického a celkového sekrečního imunoglobulinu A (sIgA), IgG, IgM a IgE, kalprotektinu a neurotoxinu odvozeného od eosinofilů (EDN). Výše uvedené zánětlivé markery ve stolici, moči a séru mohou být hodnoceny pomocí ELISA, testu cytometric bead array (CBA), multiplexní proteinové analýzy nebo průtokové cytometrie.