Microbioom en immuunprofilering bij zuigelingen met koemelkallergie

STUDIE ONTWERP

Studiebeschrijving:

Deze observationele studie omvat de analyse van klinische gegevens, stoelgang-, urine- en serummonsters (indien beschikbaar) die zullen worden verzameld bij zuigelingen met vermoedelijke of bevestigde niet-IgE-gemedieerde CMPA. Met de schriftelijke toestemming van de ouders/verzorgers zullen klinische gegevens worden verzameld uit de medische aantekeningen van de patiënten. Vuile en natte (ontlasting en urinemonsters) luiers van baby's met mogelijk niet-IgE-gemedieerde CMPA vóór uitsluiting van zuivelproducten op het moment van inschrijving, zullen worden verzameld tijdens de acute en herstelfase volgens het volgende schema:

bezoek 1: wervingsdag (twee ontlastingsmonsters bij twee opeenvolgende stoelgangen), idealiter vóór introductie van zuivelvrij dieet; bezoek 2: einde week 1; bezoek 3: einde week 4; bezoek 4: week 5, provocatie met koemelkproteïnen (CMP) (twee ontlastingsmonsters bij twee opeenvolgende stoelgangen, 6 uur tot 24 uur na provocatie); bezoek 5: binnen een week na CMP challenge; bezoek 6: week 6. Monsters van baby's met mogelijk niet-IgE-gemedieerde CMPA terwijl ze een zuivelvrij dieet volgen bij inschrijving, zullen worden verzameld bij aanvang (2 monsters bij 2 opeenvolgende stoelgangen), week 1, week 4 en week 6. Als deze patiënten binnen de 6 weken van het onderzoek worden uitgedaagd tot CMP, worden ook feces- en urinemonsters verzameld vóór (laatste stoelgang vóór de uitdaging) en na de uitdaging tot CMP (twee ontlastingsmonsters bij twee opeenvolgende stoelgangen, 6 uur tot maximaal 24 uur na de uitdaging). Voor de IgE-gemedieerde CMPA-zuigelingen en gezonde deelnemers worden feces- en urinemonsters alleen op 3 tijdstippen verzameld: op de dag van rekrutering, in week 4 en in week 6.

Zuigelingen die binnen de gezondheidsraad van Greater Glasgow & Clyde bij de eerste en tweede lijn komen met symptomen die wijzen op mogelijk niet-IgE-gemedieerde CMPA, zullen worden behandeld volgens de lokale niet-IgE-gemedieerde CMPA-richtlijn (voor zuigelingen die flesvoeding krijgen, wordt een hypoallergene flesvoeding gegeven). aangeboden; uitgebreid gehydrolyseerde (eHF) of aminozuur (AAF) formule, op basis van de ernst van de symptomen en de geschiedenis, terwijl moedermelk wordt geadviseerd om een ​​zuivelvrij dieet te volgen). Volgens de lokale richtlijnen krijgen baby's met milde tot matige niet-IgE-gemedieerde CMPA na 4 weken eliminatiedieet (koemelk van baby's en moeders als ze borstvoeding krijgen) thuis een onbewaakte orale voedselprovocatie (OFC) aangeboden onder begeleiding van de gemeenschapsdiëtist terwijl de meer strenge gevallen (zoals CMPIE) een OFC onder toezicht van een arts zullen worden aangeboden. In het geval van een overtuigende geschiedenis, zoals herhaalde blootstelling aan het beschuldigde voedsel dat herhaaldelijk braken en/of diarree opwekt binnen 24 uur, zonder enige andere oorzaak voor symptomen en afwezigheid van symptomen na eliminatie van koemelk, zal de OFC worden weggelaten. Bevestigde gevallen (na positieve uitdaging of overtuigende geschiedenis) zullen terugkeren naar het uitsluitingsdieet (een hypoallergene flesvoeding of borstvoeding met een zuivelvrij dieet van de moeder) volgens de lokale richtlijn.

Er zal een vervolgstudie worden opgezet om de proefpersonen te volgen tijdens hun verdere ontwikkeling op 3 en 5 jaar oud, aangezien het wetenschappelijk interessant zal zijn om specifieke uitkomsten in een later stadium te evalueren. Daarom zullen het deelnemersinformatieblad en het toestemmingsformulier deze optie al behandelen en ouders/verzorgers van de deelnemers vragen of de ouders/verzorgers akkoord gaan om in de toekomst gecontacteerd te worden. Op dat moment zal geïnformeerde toestemming worden gevraagd voor deelname aan een vervolgonderzoek.

Stopzetting van proefpersoon tijdens het onderzoek:

Als de ouders/verzorgers van de deelnemer besluiten hun toestemming in te trekken, worden de reeds verkregen monsters bewaard voor het onderzoek, tenzij de ouders/verzorgers van de deelnemer aangeven dit niet te doen, in welk geval de monsters worden vernietigd.

Monsters zullen worden weggegooid volgens het Greater Glasgow & Clyde NHS-beleid. Als de ouders/verzorgers van de deelnemers tijdens het onderzoek niet meer in staat zijn om toestemming te geven, wordt de deelname van het kind aan het onderzoek ingetrokken en worden identificeerbare gegevens of monsters die met toestemming zijn verzameld, bewaard en gebruikt voor het onderzoek. Er zullen geen verdere gegevens of monsters worden verzameld of andere onderzoeksprocedures worden uitgevoerd op of met betrekking tot de deelnemer.

MONSTERVERZAMELING VOOR LABORATORIUMMETINGEN

Feces- en urinemonsters:

Luiers worden door de onderzoeker opgehaald op een tijd en plaats die geschikt is voor de ouders/verzorgers van de deelnemer, inclusief de ziekenhuisafdeling of kliniek of het huis van de deelnemer. Als de ouders/verzorgers van de deelnemer het nuttig zouden vinden, zullen enkele dagen voor het verzamelen beleefdheidsbezoeken worden afgelegd en zullen er een paar dagen voor en/of tijdens het verzamelen van monsters vriendelijke herinneringen worden gegeven via sms, telefoon of e-mail om te helpen met eventuele vragen van de deelnemer hebben. Wanneer er een vuile en natte luier beschikbaar komt, zullen de ouders/verzorgers van de deelnemer de onderzoeker onmiddellijk bellen/sms'en (directe lijnnummer van de studie) voor het verzamelen en vervoeren van de monsters naar het laboratorium; het monster zal worden opgehaald door een vooruitbetaalde taxi of door de onderzoekers zelf. Voor niet-IgE-gemedieerde CMPA-deelnemers zullen ontlastings- en urinemonsters worden verzameld bij baseline (bezoek 1: wervingsdag, twee monsters op 2 opeenvolgende stoelgangen), week 1 (bezoek 2, dag 7), week 4 (bezoek 3, dag 28) en week 6 (bezoek 6: dag 37). Als een OFC wordt uitgevoerd, zullen aanvullende feces- en urinemonsters worden verzameld voorafgaand aan de herinvoering van de melk (laatste stoelgang vóór OFC), op de voedselprovocatiedag (2 monsters op 2 opeenvolgende stoelgangen, 6 uur tot 24 uur na provocatie) en na voedselprovocatie (binnen een week na de provocatie). Er zullen 3 ontlastings- en urinemonsters worden verzameld van de IgE-gemedieerde CMPA- en gezonde controlegroepen, één bij baseline (wervingsdag), één in week 4 (dag 28) en een laatste in week 6 (dag 37). Er moeten pogingen worden gedaan om bezoeken (beoordelingen) op de exacte datum te plannen. Indien dit niet mogelijk is, dienen deze binnen 48 uur ingepland te worden.

Microbiota-analyse:

Bacteriële diversiteit: diversiteit, rijkdom en relatieve overvloed van alle microbiële geslachten zal worden onderzocht met Next Generation sequencing van het 16S rRNA-gen op het IlluminaMiSeq®-platform. Bacteriële functionele capaciteit: sequentiebepaling van het hele genoom (shotgun-metagenomics) zal worden uitgevoerd op een IlluminaHiSeq®-platform. Shotgun-metagenomics zal functionele profielen van de microbiota en metabolische routes genereren door niet-geassembleerde reads in kaart te brengen in de KEGG-database van metabole routes met behulp van HUMANN. Bacteriële metabolische activiteit: Metabole fenotypering van monsters zal worden uitgevoerd met NMR/LC/GC-FID/MS en andere assays zoals eerder beschreven. Fecale metabolomics-analyse zal correlaties mogelijk maken van de metabolische kenmerken rechtstreeks met de functionele profielen en de geannoteerde bacteriële abundanties en daarmee de bepaling van de metabole rollen van de belangrijkste leden van de gemeenschap. Ziektemarkers en immunofenotypering: Fecale calprotectine zal worden gemeten uit fecale monsters om mogelijke darmontsteking bij deze patiënten te identificeren.

Na afronding van de studie worden alle monsters opgeslagen en kunnen ze worden gebruikt om dezelfde onderzoeksvragen als deze studie aan te pakken wanneer er nieuwe laboratoriummethoden ontstaan. Dit is met name relevant voor microbiologische analyse, omdat nieuwe methoden ons een beter begrip kunnen bieden van de rol van de microbiota bij darmontsteking. Toestemming om monsters op te slaan en te gebruiken in toekomstig onderzoek wordt verkregen door schriftelijke toestemming.

Bloedstalen:

Met betrekking tot het afnemen van veneuze bloedmonsters geldt dit alleen voor elke baby die in het onderzoek is opgenomen en die om klinische redenen bloedonderzoek zal ondergaan (er is geen extra naaldinbrenging vereist). Bloedmonsters verzameld voor klinische doeleinden die niet langer nodig zijn (overtollige monsters), zullen worden aangevraagd bij het hematologielaboratorium van het Royal Hospital for Children en worden overgebracht naar het laboratorium van Professor Milling aan de Universiteit van Glasgow, waar de monsters zullen worden voorbereid en opgeslagen voor de doel van deze studie. Verzamelde bloedmonsters zullen worden gebruikt om ontstekings- en immuunmarkers in het bloed te meten en om het immunofenotype te beoordelen, door middel van technieken die conventionele enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA), cytokine-multiplexanalyse, flowcytometrie en genexpressie-analyse kunnen omvatten.

Ontstekingsanalyse:

Verschillende immuuncellen en cytokines zullen worden gemeten in supernatanten van ontlasting, urine en bloed. De onderzoekers zullen zoeken naar de volgende cytokines, waaronder de volgende: Th1-cytokines: Interleukine (IL) 12, Interferon-gamma (IFN-γ), Th2-cytokines: IL-5, IL-13, IL-4, IL-9, Th17-cytokines : IL17, IL22, Treg cytokines: IL-10, Transforming growth factor beta (TGF-β) en inflammatoire cytokines: Tumornecrosefactor alfa (TNF-α), IL-1β, IL-2, IL-6 en IL- 8. De humorale immuunrespons zal worden beoordeeld door kwantificering van antigeenspecifiek en totaal uitgescheiden immunoglobuline A (sIgA), IgG, IgM en IgE, calprotectine en van eosinofiel afgeleid neurotoxine (EDN). De bovenstaande ontstekingsmarkers in ontlasting, urine en serum kunnen worden beoordeeld met ELISA, cytometrische bead array (CBA)-assay, multiplex-eiwitanalyse of flowcytometrie.