Mikrobiom og immunprofilering hos spedbarn med kumelksallergi

STUDERE DESIGN

Studiebeskrivelse:

Denne observasjonsstudien vil involvere analyse av kliniske data, avførings-, urin- og serumprøver (hvis tilgjengelig) som vil bli samlet inn fra spedbarn med mistenkt eller bekreftet ikke-IgE-mediert CMPA. Kliniske data vil bli samlet inn fra pasientens medisinske notater med skriftlig samtykke fra foreldrene/omsorgspersonene. Skitne og våte (avføring og urinprøver) bleier fra spedbarn med mulig ikke-IgE-mediert CMPA før meieriekskludering ved påmelding, vil bli samlet inn under akutt- og restitusjonsfasen i henhold til følgende tidsplan:

besøk 1: rekrutteringsdag (to avføringsprøver på to påfølgende tarmbevegelser), ideelt før introduksjon av melkefri diett; besøk 2: slutten av uke 1; besøk 3: slutten av uke 4; besøk 4: uke 5, utfordring til Cow's Milk Proteins (CMP) (to avføringsprøver på to påfølgende tarmbevegelser, 6 timer opptil 24 timer etter utfordring); besøk 5: innen en uke etter CMP-utfordring; besøk 6: uke 6. Prøver fra spedbarn med mulig ikke-IgE-mediert CMPA mens de er på melkefri diett ved påmelding vil bli samlet inn ved baseline (2 prøver på 2 påfølgende tarmbevegelser), uke 1, uke 4 og uke 6. Hvis disse pasientene utfordres til CMP innen 6 uker av studien, vil det også tas avførings- og urinprøver før (siste avføring før utfordring) og etter utfordring med CMP (to avføringsprøver på to påfølgende tarmbevegelser, 6 timer t.o.m. 24 timer etter utfordring). For IgE-mediert CMPA-spedbarn og friske deltakere, vil avførings- og urinprøver kun bli samlet inn på 3 tidspunkter: på rekrutteringsdagen, i uke 4 og uke 6.

Spedbarn som presenteres for primær- og sekundærhelsetjenesten i Greater Glasgow & Clyde helsestyre med symptomer som tyder på mulig ikke-IgE-mediert CMPA, vil bli behandlet i henhold til den lokale ikke-IgE-mediert CMPA-retningslinjen (for spedbarn som får morsmelkerstatning vil en hypoallergen melkeblanding være tilbudt; omfattende hydrolysert (eHF) eller aminosyre (AAF) formel, basert på alvorlighetsgraden av symptomene og historien, mens de på morsmelk vil moren bli rådet til å gå på en melkefri diett). I henhold til lokale retningslinjer, vil spedbarn med mild til moderert ikke-IgE-mediert CMPA, etter 4 ukers eliminasjonsdiett (kumelk fra spedbarns og mors hvis de ammes), tilbys en uovervåket oral matutfordring (OFC) hjemme under veiledning av fellesskapets kostholdsekspert, mens mer alvorlige tilfeller (som CMPIE) vil bli tilbudt en OFC under leges tilsyn. Ved en overbevisende historie som gjentatt eksponering for den inkriminerte maten som fremkaller gjentatte oppkast og/eller diaré innen 24 timer, uten annen årsak til symptomer og fravær av symptomer etter eliminering av kumelk, vil OFC utelates. Bekreftede tilfeller (etter positiv utfordring eller overbevisende historie) vil gå tilbake til eksklusjonsdietten (en hypoallergen formelmelk eller amming med mors melkefrie diett) i henhold til lokale retningslinjer.

Det vil bli satt opp en oppfølgingsstudie for å følge forsøkspersonene under deres videre utvikling ved 3 og 5 års alder da det vil være vitenskapelig interessant å evaluere spesifikke utfall på et senere tidspunkt. Derfor vil deltakerinformasjonsarket og samtykkeskjemaet allerede ta for seg dette alternativet og spørre foreldre/foresatte til deltakerne om foreldrene/omsorgspersonene godtar å bli kontaktet i fremtiden. Informert samtykke for deltakelse i en oppfølgingsstudie vil bli bedt om på det tidspunktet.

Avbrytelse av emnet under studien:

Dersom deltakerens foreldre/omsorgspersoner bestemmer seg for å trekke tilbake samtykket, vil prøver som allerede er innhentet bli oppbevart for studien med mindre deltakerens foreldre/omsorgspersoner forteller oss å ikke gjøre det, i så fall vil prøvene bli destruert.

Prøver vil bli kastet i henhold til Greater Glasgow & Clyde NHS retningslinjer. Skulle deltakernes foreldre/omsorgspersoner miste evnen til å samtykke under studien, vil spedbarnets deltakelse i studien bli trukket tilbake og identifiserbare data eller prøver samlet inn med samtykke vil bli beholdt og brukt til studien. Ingen ytterligere data eller prøver vil bli samlet inn eller andre forskningsprosedyrer utført på eller i forhold til deltakeren.

PRØVEINNSAMLING FOR LABORATORIEMÅLING

Avførings- og urinprøver:

Bleier vil bli hentet av forskeren på et tidspunkt og sted som er hensiktsmessig for deltakerens foreldre/omsorgspersoner, inkludert sykehusavdelingen eller klinikken eller deltakerens hjem. Hvis deltakerens foreldre/omsorgspersoner synes det er nyttig, vil det bli foretatt høflighetsoppringninger noen dager før henting, og milde påminnelser via tekst, telefon eller e-post vil bli gitt noen dager før og/eller under prøvesamlingen for å hjelpe med eventuelle spørsmål deltakeren måtte ha. ha. Når en skitten og våt bleie blir tilgjengelig, vil deltakerens foreldre/foresatte ringe/tekste forskeren (studiens direktelinjenummer) umiddelbart for innsamling og transport av prøvene til laboratoriet; prøven vil enten bli hentet av en forhåndsbetalt taxi eller av forskerne selv. For ikke-IgE-mediert CMPA-deltakere vil avførings- og urinprøver bli samlet inn ved baseline (besøk 1: rekrutteringsdag, to prøver på 2 påfølgende tarmbevegelser), uke 1 (besøk 2, dag 7), uke 4 (besøk 3, dag 28) og uke 6 (besøk 6: dag 37). Hvis en OFC utføres, vil ytterligere avførings- og urinprøver tas før melkeinnføring (siste avføring før OFC), på matutfordringsdagen (2 prøver på 2 påfølgende tarmbevegelser, 6 timer opp til 24 timer etter utfordring) og etter matutfordring (innen en uke etter utfordring). 3 avførings- og urinprøver vil bli samlet inn fra IgE-mediert CMPA og friske kontrollgrupper, en ved baseline (rekrutteringsdag), en i uke 4 (dag 28) og en siste i uke 6 (dag 37). Det bør forsøkes å planlegge besøk (vurderinger) på nøyaktig dato. Hvis dette ikke er mulig, bør disse planlegges innen et 48-timers vindu.

Mikrobiotaanalyse:

Bakteriell mangfold: Mangfold, rikdom og relativ overflod av alle mikrobielle slekter vil bli utforsket med neste generasjons sekvensering av 16S rRNA-genet på IlluminaMiSeq®-plattformen. Bakteriell funksjonell kapasitet: Helgenomsekvensering (hagle-metagenomikk) vil bli utført på en IlluminaHiSeq®-plattform. Hagle-metagenomikk vil generere funksjonelle profiler av mikrobiota og metabolske veier ved å kartlegge umonterte avlesninger til KEGG-databasen over metabolske veier ved å bruke HUManN. Bakteriell metabolsk aktivitet: Metabolsk fenotyping av prøver vil bli utført med NMR/LC/GC-FID/MS og andre analyser som beskrevet tidligere. Fekal metabolomikkanalyse vil muliggjøre korrelasjoner av de metabolske signaturene direkte med funksjonsprofilene og de kommenterte bakterielle overflodene og dermed bestemmelse av de metabolske rollene til nøkkelfellesskapets medlemmer. Sykdomsmarkører og immunfenotyping: Fekalt kalprotektin vil bli målt fra fekale prøver for å identifisere mulig tykktarmsbetennelse hos disse pasientene.

Når studien er fullført, vil alle prøvene bli lagret og kan brukes til å løse de samme forskningsspørsmålene som denne studien når nye laboratoriemetoder oppstår. Dette er spesielt relevant for mikrobiologisk analyse, da nye metoder kan gi oss en bedre forståelse av mikrobiotaens rolle i tarmbetennelse. Tillatelse til å lagre prøver og bruk i fremtidig forskning vil bli innhentet ved skriftlig samtykke.

Blodprøver:

Når det gjelder innsamling av venøse blodprøver, vil dette kun gjelde for spedbarn som er inkludert i studien som skal gjennomgå blodprøver av kliniske årsaker (ingen ekstra kanyleinnføring er nødvendig). Blodprøver samlet inn for kliniske formål som ikke lenger er nødvendig (overflødige prøver), vil bli forespurt fra hematologilaboratoriet ved Royal Hospital for Children og overført til professor Millings laboratorium ved University of Glasgow hvor prøvene vil bli klargjort og lagret for formålet med denne studien. Innsamlede blodprøver vil bli brukt til å måle blodinflammatoriske og immune markører, og for å vurdere immunfenotypen, ved hjelp av teknikker som kan inkludere konvensjonell enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA), cytokinmultipleksanalyse, flowcytometri og genekspresjonsanalyse.

Inflammatorisk analyse:

Ulike immunceller og cytokiner vil bli målt i avføringssupernatanter, urin og blod. Undersøkerne vil se etter følgende cytokiner, inkludert følgende: Th1 cytokiner: Interleukin (IL) 12, Interferon gamma (IFN-γ), Th2 cytokiner: IL-5, IL-13, IL-4, IL-9, Th17 cytokiner : IL17, IL22, Treg-cytokiner: IL-10, Transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) og inflammatoriske cytokiner: Tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), IL-1β, IL-2, IL-6 og IL- 8. Den humorale immunresponsen vil bli vurdert ved kvantifisering av antigenspesifikk og totalt sekretorisk immunglobulin A (sIgA), IgG, IgM og IgE, calprotectin og eosinofil-avledet neurotoxin (EDN). Ovennevnte inflammatoriske markører i avføring, urin og serum kan vurderes ved ELISA, cytometrisk bead array (CBA) analyse, multipleks proteinanalyse eller flowcytometri.