Biologická dostupnost kyseliny oleanolové formulované jako funkční olivový olej (BIO-OLTRAD)

Návrh a implementace testů biologické dostupnosti Studium orální biologické dostupnosti kyseliny oleanolové (OA) ve formě funkčního olivového oleje a jejích mechanismů systémového transportu bude přiblíženo pomocí postprandiální intervence na 20 zdravých dobrovolnících.

Účastníci budou přijati poté, co kompletní biochemická a hematologická analýza přinese výsledky v normálních mezích a po kontrole v jejich elektronické anamnéze, že netrpí zažívacími, metabolickými nebo onkologickými poruchami nebo jinou patologií, která podle názoru klinických výzkumníků , by jim mohlo zabránit v účasti na soudním řízení. Pro jejich zařazení do studie je také nutné, aby udělili písemný souhlas s protokoly schválenými Institucionálními výbory pro lidský výzkum poté, co byli vhodně informováni ústně i písemně.

Terénní práce budou prováděny v Denní nemocnici endokrinologické a nutriční služby univerzitních nemocnic „Virgen del Rocio“ ze Sevilly (ŠPANĚLSKO).

Velikost vzorku. Hlavní kvantitativní proměnnou, která má být v této studii zkoumána, je koncentrace OA v séru. Vzhledem k tomu, že dosud nebyly zveřejněny konzistentní výchozí údaje, byly použity údaje z analýzy OA v séru studie PREDIABOLE (ISRCTN03372660). Byla vybrána kohorta 25 účastníků z kontrolní skupiny, kteří konzumovali komerční olivový olej, a byla stanovena průměrná výchozí koncentrace 155 ± 72 ng OA/ml. Vzhledem k tomu se nyní předpokládá, že obsah OA v plazmě se zvýší nejméně o 50 % v důsledku příjmu funkčního olivového oleje (ekvivalentní dávka 30 mg OA). K prokázání tohoto testu jednostranné hypotézy s hladinou spolehlivosti 90 % (riziko α=0,01, zα=1,645) a mocninou 95 % (zβ=1,645) je zapotřebí velikost vzorku alespoň 17 dobrovolníků. Za předpokladu, že ztráty nižší než 15 % jsou tolerovatelné, upravená velikost vzorku by byla 20 subjektů.

Anamnéza a fyzikální vyšetření účastníků. Anamnéza bude zahrnovat životně důležité údaje a obecnou anamnézu shromažďující všechny symptomy, které může jedinec mít, jeho lékařskou a chirurgickou anamnézu, stejně jako následnou farmakologickou léčbu. Dále budou získány informace o životním stylu, vnímání vlastního těla, stravování a druhu a intenzitě pohybové aktivity. Dále bude vyšetřena svalová hmota, tukový kompartment (adipózní panniculus), přítomnost otoků atd. Stejně tak bude stanoven systolický a diastolický krevní tlak a srdeční frekvence.

Antropometrická studie a složení těla. Antropometrická studie bude zahrnovat stanovení celkové tělesné hmotnosti, výšky, indexu tělesné hmotnosti (BMI) a také obvodů pasu a boků. Studium a hodnocení těchto proměnných bude prováděno v souladu se směrnicemi Mezinárodní společnosti pro pokrok v kinantropometrii (ISAK). Studium tělesného složení bude provedeno elektrickou bioimpedancí za použití analyzátoru tělesného složení TANITA® model BC-418MA. Tuková hmota, netuková hmota, svalová hmota, celková voda, kostní hmota, bazální metabolismus a viscerální tuk budou kvantifikovány touto technikou s využitím predikčních rovnic ověřených a upravených podle věku a pohlaví.

Biochemické studie. Budou odebrány vzorky kubitální krve nalačno pro stanovení parametrů celkové, jaterní a renální biochemie. Kromě toho bude provedena kompletní analýza moči, která zahrnuje obvyklá fyzikální, chemická a mikroskopická měření. Tato stanovení budou provedena v Laboratoři analýzy a klinické biochemie univerzitních nemocnic 'Virgen del Rocío' v Seville.

Intervence Účastníci budou vyzváni, aby se vyhnuli konzumaci alkoholických nápojů a tabáku během dne před provedením testů. Ve zkušebních dnech a po 12 hodinách celonočního hladovění budou odebrány vzorky krve z loketní žíly. Následně deset náhodně vybraných jedinců dostane 55 ml funkčního olivového oleje obohaceného OA (ekvivalentní dávka 30 mg OA) jako součást experimentální snídaně, která zahrnuje kávu, odstředěné mléko a celozrnný toast. Dalších deset účastníků dostane v rámci experimentálního jídla stejné množství kontrolního olivového oleje. Po konzumaci příslušných snídaní budou každou hodinu odebírány alikvoty loketní krve po dobu 7 hodin po jídle. Během této doby bude umožněn volný přístup k odběru vody.

Je stanoveno čtyřtýdenní vymývací období, po kterém bude provedena nová série testů, které překračují typ konzumovaného olivového oleje.

Farmakokinetická studie OA Z alikvotů kubitální krve se získají séra centrifugací a jako konzervační látky se přidají NaN3, PMSF a aprotinin, aby se zabránilo jejich proteolytické degradaci. Vzorky séra budou až do analýzy skladovány při -80 °C v laboratořích IG-CSIC. Extrakce a frakcionace sérového OA bude realizována extrakcemi kapalina/kapalina a pevná fáze, zatímco identifikace a kvantifikace triterpenu bude dokončena pomocí GC-FID a GC-MS. Při farmakokinetické analýze dat bude uvažován monokompartmentový model. Z údajů o sérovém obsahu volné OA v průběhu postprandiálního období budou stanoveny následující parametry: 1) parametry absorpce, jako je maximální dosažená koncentrace a její načasování, konstanta absorpce a plocha pod křivkou; 2) distribuční parametry, jako je konstanta a distribuční objem; 3) parametry metabolismu, jako je frakce OA spojená s albuminem; a 4) eliminační parametry, jako je eliminační konstanta, poločas a clearance. Pro výpočty bude použit modul farmakokinetické analýzy SigmaPLot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA).

Studie přítomnosti OA v lipoproteinech bohatých na triglyceridy (TRL). Chylomikrony budou nejprve izolovány z plazmy v normálním fyziologickém roztoku centrifugací při 100 000 × g po dobu 20 minut. Lipoproteiny s velmi nízkou hustotou (VLDL) budou následně separovány při 230 000 × g po dobu 18 hodin. Frakce chylomikronů a VLDL budou hydrolyzovány pankreatickým enzymem. Uvolněné lipidy budou extrahovány směsí chloroform:methanol (2:1) a frakcionovány extrakcí pevná látka/kapalina směsí methanol:chloroform (1:1) a isopropanol:acetonitril:voda (2:1:1). Složení volných mastných kyselin (FFA) bude analyzováno pomocí GC-FID jako odpovídající methylestery. Možná přítomnost OA mezi lipidy odvozenými od TRL bude hodnocena po frakcionaci a analýze GC-MS. Obsah apo B48 a B100, jako markerů přítomnosti chylomikronů, respektive VLDL, bude stanoven pomocí ELISA.

Další biochemické parametry sérový inzulín, C-peptid a GLP-1 budou analyzovány pomocí ELISA.