Bioverfügbarkeit von Oleanolsäure, formuliert als funktionelles Olivenöl (BIO-OLTRAD)

Design und Implementierung der Bioverfügbarkeitsassays Die Untersuchung der oralen Bioverfügbarkeit von Oleanolsäure (OA), wenn sie als funktionelles Olivenöl formuliert ist, und ihrer Mechanismen des systemischen Transports wird durch eine postprandiale Intervention mit 20 gesunden Freiwilligen angegangen.

Die Teilnehmer werden rekrutiert, nachdem die Ergebnisse der vollständigen biochemischen und hämatologischen Analyse innerhalb normaler Grenzen liegen und nachdem in ihren elektronischen Krankengeschichten überprüft wurde, dass sie nicht an Verdauungs-, Stoffwechsel- oder onkologischen Störungen oder anderen Pathologien leiden, die nach Meinung der klinischen Prüfärzte vorliegen , könnte sie daran hindern, an dem Prozess teilzunehmen. Für ihre Aufnahme in die Studie ist es auch erforderlich, dass sie die schriftliche Zustimmung zu den von den Institutional Committees for Human Research genehmigten Protokollen erteilen, nachdem sie sowohl mündlich als auch schriftlich entsprechend informiert wurden.

Die Feldarbeit wird im Tageskrankenhaus des Dienstes für Endokrinologie und Ernährung der Universitätskliniken „Virgen del Rocio“ in Sevilla (SPANIEN) durchgeführt.

Stichprobengröße. Die wichtigste quantitative Variable, die in dieser Studie untersucht werden soll, ist die OA-Serumkonzentration. In Ermangelung bisher veröffentlichter konsistenter Ausgangsdaten wurden Daten aus der Analyse von OA in Seren der PREDIABOLE-Studie (ISRCTN03372660) verwendet. Eine Kohorte von 25 Teilnehmern aus der Kontrollgruppe, die handelsübliches Olivenöl konsumierten, wurde ausgewählt, und eine durchschnittliche Ausgangskonzentration von 155 ± 72 ng OA/ml wurde bestimmt. Vor diesem Hintergrund wird nun postuliert, dass der Plasma-OA-Gehalt infolge der Einnahme des funktionellen Olivenöls (Äquivalentdosis 30 mg OA) um mindestens 50 % ansteigt. Um diesen einseitigen Hypothesentest mit einem Konfidenzniveau von 90 % (Risiko α=0,01, zα=1,645) und einer Power von 95 % (zβ=1,645) zu beweisen, ist eine Stichprobengröße von mindestens 17 Freiwilligen erforderlich. Unter der Annahme, dass Verluste von weniger als 15 % tolerierbar sind, würde die angepasste Stichprobengröße 20 Probanden betragen.

Anamnese und körperliche Untersuchung der Teilnehmer. Die Anamnese umfasst Vitaldaten und die allgemeine Anamnese, in der alle Symptome erfasst werden, die die Person möglicherweise aufweist, ihre medizinische und chirurgische Vorgeschichte sowie die durchgeführten pharmakologischen Behandlungen. Auch Informationen über Lebensstil, Wahrnehmung des eigenen Körperbildes, Ernährung sowie Art und Intensität der körperlichen Betätigung werden erhoben. Außerdem werden Muskelmasse, Fettkompartiment (adipose Panniculus), Vorhandensein von Ödemen etc. untersucht. Ebenso werden systolischer und diastolischer Blutdruck sowie die Herzfrequenz bestimmt.

Anthropometrische Studie und Körperzusammensetzung. Die anthropometrische Untersuchung umfasst die Bestimmung des Gesamtkörpergewichts, der Körpergröße, des Body-Mass-Index (BMI) sowie des Taillen- und Hüftumfangs. Die Untersuchung und Bewertung dieser Variablen erfolgt gemäß den Richtlinien der International Society for the Advancement of Kinanthropometry (ISAK). Die Untersuchung der Körperzusammensetzung wird durch elektrische Bioimpedanz unter Verwendung eines TANITA®-Körperzusammensetzungsanalysators, Modell BC-418MA, durchgeführt. Fettmasse, Magermasse, Muskelmasse, Gesamtwasser, Knochenmasse, Grundumsatz und viszerales Fett werden mit dieser Technik quantifiziert, wobei Vorhersagegleichungen verwendet werden, die nach Alter und Geschlecht validiert und angepasst wurden.

Biochemische Studien. Zur Bestimmung der Parameter der allgemeinen, hepatischen und renalen Biochemie werden Proben von nüchternem Cubitalblut entnommen. Darüber hinaus wird eine vollständige Urinanalyse durchgeführt, die die üblichen physikalischen, chemischen und mikroskopischen Messungen umfasst. Diese Bestimmungen werden im Labor für Analyse und klinische Biochemie des Universitätskrankenhauses „Virgen del Rocío“ in Sevilla durchgeführt.

Intervention Die Teilnehmer werden ermutigt, den Konsum von alkoholischen Getränken und Tabak am Tag vor der Durchführung der Tests zu vermeiden. An Probetagen und nach 12-stündigem Fasten über Nacht werden Blutproben aus der Vena cubitalis entnommen. Anschließend erhalten zehn zufällig ausgewählte Personen 55 ml des funktionellen OA-angereicherten Olivenöls (äquivalente Dosis 30 mg OA) als Teil eines experimentellen Frühstücks, das Kaffee, Magermilch und Vollkorntoast umfasst. Die anderen zehn Teilnehmer erhalten innerhalb der Versuchsmahlzeit die gleiche Menge des Kontroll-Olivenöls. Nach dem Essen der jeweiligen Frühstücke werden über einen postprandialen Zeitraum von 7 Stunden stündlich Aliquots von Blut aus der Ellenbeuge entnommen. Während dieser Zeit ist der freie Zugang zur Wasserentnahme erlaubt.

Es wird eine vierwöchige Auswaschphase festgelegt, nach der eine neue Reihe von Tests durchgeführt wird, die die Art des konsumierten Olivenöls kreuzen.

Pharmakokinetische Untersuchung von OA Aus den Aliquots von Blut aus der Kubita werden Seren durch Zentrifugation gewonnen, und NaN3, PMSF und Aprotinin werden als Konservierungsmittel hinzugefügt, um ihren proteolytischen Abbau zu vermeiden. Serumproben werden bis zur Analyse bei -80 0C in den Laboren des IG-CSIC gelagert. Die Extraktion und Fraktionierung von Serum-OA wird durch Flüssig/Flüssig- und Festphasenextraktionen realisiert, während die Identifizierung und Quantifizierung des Triterpens durch GC-FID und GC-MS abgeschlossen wird. Bei der pharmakokinetischen Analyse der Daten wird ein Monokompartiment-Modell angenommen. Aus Daten des Serumgehalts an freiem OA während der postprandialen Periode werden die folgenden Parameter bestimmt: 1) Absorptionsparameter, wie die erreichte maximale Konzentration und der Zeitpunkt dafür, die Absorptionskonstante und die Fläche unter der Kurve; 2) Verteilungsparameter wie Verteilungskonstante und Verteilungsvolumen; 3) Stoffwechselparameter, wie die mit Albumin assoziierte OA-Fraktion; und 4) Eliminationsparameter wie die Eliminationskonstante, die Halbwertszeit und die Clearance. Für Berechnungen wird das pharmakokinetische Analysemodul SigmaPLot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) verwendet.

Untersuchung des Vorhandenseins von OA in triglyceridreichen Lipoproteinen (TRL). Chylomikronen werden zunächst aus Plasma in normaler Kochsalzlösung durch 20-minütige Zentrifugation bei 100.000 × g isoliert. Lipoproteine ​​sehr niedriger Dichte (VLDL) werden anschließend bei 230.000 × g für 18 h getrennt. Die Chylomikronen- und VLDL-Fraktionen werden mit Pankreasenzym hydrolysiert. Die freigesetzten Lipide werden mit Chloroform:Methanol (2:1) extrahiert und durch Fest/Flüssig-Extraktion mit Methanol:Chloroform (1:1) und Isopropanol:Acetonitril:Wasser (2:1:1) fraktioniert. Die Zusammensetzung der freien Fettsäuren (FFA) wird durch GC-FID als die entsprechenden Methylester analysiert. Das mögliche Vorhandensein von OA unter den von TRL abgeleiteten Lipiden wird nach Fraktionierung und GC-MS-Analyse bewertet. Der Gehalt an Apo B48 und B100 als Marker für das Vorhandensein von Chylomikronen bzw. VLDL wird durch ELISA bestimmt.

Weitere biochemische Parameter Seruminsulin, C-Peptid und GLP-1 werden mittels ELISA analysiert.