Biodisponibilidad del ácido oleanólico formulado como aceite de oliva funcional (BIO-OLTRAD)

Diseño e implementación de los ensayos de biodisponibilidad El estudio de la biodisponibilidad oral del ácido oleanólico (AO) cuando se formula como aceite de oliva funcional, y sus mecanismos de transporte sistémico, se abordará mediante una intervención posprandial con 20 voluntarios sanos.

Los participantes serán reclutados luego de que los análisis bioquímicos y hematológicos completos arrojen resultados dentro de los límites normales, y luego de verificar en sus historias clínicas electrónicas que no padezcan trastornos digestivos, metabólicos, oncológicos o cualquier otra patología que, a juicio de los investigadores clínicos. , podría impedirles participar en el juicio. Para su inclusión en el ensayo, también se requiere que otorguen el consentimiento por escrito a los protocolos aprobados por los Comités Institucionales de Investigación en Seres Humanos, luego de ser convenientemente informados tanto oral como documentalmente.

El trabajo de campo se realizará en el Hospital de Día del Servicio de Endocrinología y Nutrición de los Hospitales Universitarios 'Virgen del Rocío' de Sevilla (ESPAÑA).

Tamaño de la muestra. La principal variable cuantitativa que se examinará en este ensayo es la concentración sérica de OA. En ausencia de datos de referencia coherentes publicados hasta el momento, se han utilizado los datos del análisis de OA en sueros del estudio PREDIABOLE (ISRCTN03372660). Se seleccionó una cohorte de 25 participantes del grupo de control que consumía aceite de oliva comercial y se determinó una concentración inicial promedio de 155 ± 72 ng OA/mL. Teniendo esto en cuenta, ahora se postula que el contenido de AO en plasma aumentará al menos un 50% como consecuencia de la ingesta del aceite de oliva funcional (dosis equivalente de 30 mg de AO). Para probar esta prueba de hipótesis unilateral, con un nivel de confianza del 90% (riesgo α=0,01, zα=1,645) y una potencia del 95% (zβ=1,645), se requiere un tamaño de muestra de al menos 17 voluntarios. Suponiendo que las pérdidas inferiores al 15 % sean tolerables, el tamaño de muestra ajustado sería de 20 sujetos.

Anamnesis y exploración física de los participantes. La anamnesis incluirá los datos vitales y la historia general recogiendo todos los síntomas que pueda presentar el individuo, su historial médico y quirúrgico, así como los tratamientos farmacológicos seguidos. También se obtendrá información sobre estilo de vida, percepción de la propia imagen corporal, alimentación y tipo e intensidad de actividad física. Además, se examinará la masa muscular, compartimiento graso (panículo adiposo), existencia de edema, etc. Asimismo, se determinará la presión arterial sistólica, diastólica y la frecuencia cardiaca.

Estudio antropométrico y composición corporal. El estudio antropométrico incluirá la determinación del peso corporal total, la talla, el índice de masa corporal (IMC), así como las circunferencias de cintura y cadera. El estudio y evaluación de estas variables se realizará de acuerdo con las directrices de la Sociedad Internacional para el Avance de la Cineantropometría (ISAK). El estudio de la composición corporal se realizará por bioimpedancia eléctrica, utilizando un analizador de composición corporal TANITA® modelo BC-418MA. Con esta técnica se cuantificará masa grasa, masa magra, masa muscular, agua total, masa ósea, metabolismo basal y grasa visceral, haciendo uso de ecuaciones de predicción validadas y ajustadas por edad y sexo.

Estudios bioquímicos. Se extraerán muestras de sangre cubital en ayunas para determinar los parámetros de bioquímica general, hepática y renal. Además, se realizará una analítica de orina completa, que incluirá las habituales medidas físicas, químicas y microscópicas. Estas determinaciones se realizarán en el Laboratorio de Análisis y Bioquímica Clínica del Hospital Universitario 'Virgen del Rocío' de Sevilla.

Intervención Se animará a los participantes a evitar el consumo de bebidas alcohólicas y tabaco durante el día anterior a la realización de los ensayos. En los días de prueba, y después de 12 horas de ayuno nocturno, se extraerán muestras de sangre de la vena cubital. Posteriormente, diez individuos seleccionados aleatoriamente recibirán 55 mL del aceite de oliva funcional enriquecido con AO (dosis equivalente 30 mg AO) como parte de un desayuno experimental, que incluye café, leche desnatada y tostadas integrales. Los otros diez participantes recibirán dentro de la comida experimental la misma cantidad del aceite de oliva control. Después de tomar los desayunos respectivos, se extraerán alícuotas de sangre cubital cada hora, durante un período posprandial de 7 horas. Durante este tiempo se permitirá el libre acceso a la toma de agua.

Se establece un periodo de lavado de cuatro semanas, tras las cuales se realizará una nueva serie de pruebas que cruzan el tipo de aceite de oliva consumido.

Estudio farmacocinético de la OA De las alícuotas de sangre cubital se obtendrán sueros por centrifugación, y se les añadirá NaN3, PMSF y aprotinina como conservantes, para evitar su degradación proteolítica. Las muestras de suero se conservarán a -80 0C en los laboratorios del IG-CSIC hasta su análisis. La extracción y fraccionamiento del suero OA se realizará mediante extracciones en fase líquida/líquida y sólida, mientras que la identificación y cuantificación del triterpeno se completará mediante GC-FID y GC-MS. En el análisis farmacocinético de los datos, se supondrá un modelo monocompartimental. A partir de los datos de los contenidos séricos de AO libre a lo largo del período posprandial se determinarán los siguientes parámetros: 1) parámetros de absorción como la concentración máxima alcanzada y el momento de la misma, la constante de absorción y el área bajo la curva; 2) parámetros de distribución como la constante y el volumen de distribución; 3) parámetros metabólicos, como la fracción OA asociada a la albúmina; y 4) parámetros de eliminación tales como la constante de eliminación, la vida media y el aclaramiento. Para los cálculos se utilizará el módulo de análisis farmacocinético SigmaPLot (Systat Software Inc., San Jose, CA, EE. UU.).

Estudio de la presencia de OA en lipoproteínas ricas en triglicéridos (TRL). Los quilomicrones se aislarán primero del plasma en solución salina normal mediante centrifugación a 100 000 × g durante 20 min. Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) se separarán posteriormente a 230.000 × g durante 18 h. Las fracciones de quilomicrones y VLDL se hidrolizarán con enzima pancreática. Los lípidos liberados se extraerán con cloroformo:metanol (2:1) y se fraccionarán mediante extracción sólido/líquido con metanol:cloroformo (1:1) e isopropanol:acetonitrilo:agua (2:1:1). La composición de ácidos grasos libres (FFA) se analizará mediante GC-FID como los ésteres metílicos correspondientes. La posible presencia de OA entre los lípidos derivados de TRL se evaluará después del fraccionamiento y análisis GC-MS. El contenido de apo B48 y B100, como marcadores de la presencia de quilomicrones y VLDL, respectivamente, se determinará por ELISA.

Otros parámetros bioquímicos de insulina sérica, péptido C y GLP-1 serán analizados por ELISA.