Biodostępność kwasu oleanolowego sformułowanego jako funkcjonalna oliwa z oliwek (BIO-OLTRAD)

Projektowanie i wdrażanie testów biodostępności Badanie biodostępności kwasu oleanolowego (OA) po podaniu doustnym w postaci funkcjonalnej oliwy z oliwek oraz jego mechanizmów transportu ogólnoustrojowego zostanie przeprowadzone poprzez interwencję poposiłkową z udziałem 20 zdrowych ochotników.

Uczestnicy zostaną zwerbowani po przeprowadzeniu pełnej analizy biochemicznej i hematologicznej wyników w granicach normy oraz po sprawdzeniu w elektronicznej historii choroby, czy nie cierpią na zaburzenia trawienne, metaboliczne, onkologiczne lub inne patologie, które zdaniem badaczy klinicznych , mogłoby uniemożliwić im udział w badaniu. Do włączenia ich do badania wymagana jest również pisemna zgoda na protokoły zatwierdzone przez Komitety Instytucjonalne ds. Badań na Ludziach, po dogodnym poinformowaniu ustnym i dokumentowym.

Badania terenowe będą prowadzone w Dziennym Szpitalu Oddziału Endokrynologii i Żywienia Szpitali Uniwersyteckich „Virgen del Rocio” z Sewilli (HISZPANIA).

Wielkość próbki. Główną zmienną ilościową, którą należy zbadać w tym badaniu, jest stężenie OA w surowicy. Wobec braku opublikowanych dotychczas spójnych danych wyjściowych wykorzystano dane z analizy OA w surowicach z badania PREDIABOLE (ISRCTN03372660). Wybrano kohortę 25 uczestników z grupy kontrolnej, spożywających handlową oliwę z oliwek, i określono średnie stężenie wyjściowe na poziomie 155 ± 72 ng OA/ml. Biorąc to pod uwagę, obecnie postuluje się, że zawartość OA w osoczu wzrośnie o co najmniej 50% w wyniku spożycia funkcjonalnej oliwy z oliwek (dawka równoważna 30 mg OA). Aby udowodnić ten jednostronny test hipotezy, przy poziomie ufności 90% (ryzyko α=0,01, zα=1,645) i mocy 95% (zβ=1,645), wymagana jest próba o wielkości co najmniej 17 ochotników. Zakładając, że dopuszczalne są straty mniejsze niż 15%, skorygowana wielkość próby wyniosłaby 20 osób.

Anamneza i badanie fizykalne uczestników. Anamneza będzie zawierała dane życiowe i historię ogólną, zbierając wszystkie objawy, jakie może wykazywać dana osoba, jej historię medyczną i chirurgiczną, a także zastosowane leczenie farmakologiczne. Uzyskane zostaną również informacje na temat stylu życia, postrzegania obrazu własnego ciała, diety oraz rodzaju i intensywności aktywności fizycznej. Dodatkowo zostanie zbadana masa mięśniowa, przedział tłuszczowy (podkładka tłuszczowa), obecność obrzęku itp. Podobnie zostanie określone skurczowe i rozkurczowe ciśnienie krwi oraz częstość akcji serca.

Badanie antropometryczne i skład ciała. Badanie antropometryczne obejmie określenie całkowitej masy ciała, wzrostu, wskaźnika masy ciała (BMI) oraz obwodów talii i bioder. Badanie i ocena tych zmiennych zostanie przeprowadzona zgodnie z wytycznymi International Society for the Advancement of kinanthropometry (ISAK). Badanie składu ciała zostanie przeprowadzone metodą bioimpedancji elektrycznej, przy użyciu analizatora składu ciała TANITA® model BC-418MA. Masa tłuszczu, masa beztłuszczowa, masa mięśniowa, całkowita zawartość wody, masa kostna, podstawowy metabolizm i tłuszcz trzewny zostaną określone ilościowo za pomocą tej techniki, z wykorzystaniem równań prognostycznych zweryfikowanych i dostosowanych do wieku i płci.

Badania biochemiczne. Pobrane zostaną próbki krwi z łokcia na czczo w celu określenia parametrów biochemii ogólnej, wątrobowej i nerkowej. Ponadto zostanie przeprowadzona pełna analiza moczu, która obejmuje zwyczajowe pomiary fizyczne, chemiczne i mikroskopowe. Oznaczenia te zostaną przeprowadzone w Laboratorium Analiz i Biochemii Klinicznej Szpitala Uniwersyteckiego „Virgen del Rocío” w Sewilli.

Interwencja Uczestnicy będą zachęcani do unikania spożywania napojów alkoholowych i tytoniu w dniu poprzedzającym wykonanie testów. W dni próbne i po 12 godzinach nocnego postu pobierane będą próbki krwi z żyły łokciowej. Następnie dziesięć losowo wybranych osób otrzyma 55 ml funkcjonalnej oliwy z oliwek wzbogaconej w OA (równoważna dawka 30 mg OA) jako część eksperymentalnego śniadania, które obejmuje kawę, odtłuszczone mleko i tosty pełnoziarniste. Pozostałych dziesięciu uczestników otrzyma w ramach eksperymentalnego posiłku taką samą ilość kontrolnej oliwy z oliwek. Po zjedzeniu odpowiednich śniadań, próbki krwi z łokcia będą pobierane co godzinę, w okresie poposiłkowym wynoszącym 7 godzin. W tym czasie dozwolony będzie swobodny dostęp do ujęcia wody.

Ustanawia się czterotygodniowy okres wymywania, po którym zostanie przeprowadzona nowa seria testów obejmujących rodzaj spożywanej oliwy z oliwek.

Badanie farmakokinetyczne OA Z podwielokrotności krwi łokciowej zostaną uzyskane surowice przez odwirowanie, a NaN3, PMSF i aprotynina zostaną dodane jako środki konserwujące, aby uniknąć ich degradacji proteolitycznej. Próbki surowicy będą przechowywane w -80 0C w laboratoriach IG-CSIC do czasu analizy. Ekstrakcja i frakcjonowanie OA surowicy będzie realizowane za pomocą ekstrakcji ciecz/ciecz i fazy stałej, podczas gdy identyfikacja i oznaczanie ilościowe triterpenów zostanie zakończone za pomocą GC-FID i GC-MS. W farmakokinetycznej analizie danych zostanie przyjęty model jednokompartmentowy. Na podstawie danych dotyczących zawartości w surowicy wolnej OA w całym okresie poposiłkowym zostaną określone następujące parametry: 1) parametry wchłaniania, takie jak maksymalne osiągnięte stężenie i czas jego osiągnięcia, stała wchłaniania i pole pod krzywą; 2) parametry dystrybucji, takie jak stała i objętość dystrybucji; 3) parametry metabolizmu, takie jak frakcja OA związana z albuminą; i 4) parametry eliminacji, takie jak stała eliminacji, okres półtrwania i klirens. Do obliczeń wykorzystany zostanie moduł analizy farmakokinetycznej SigmaPLot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA).

Badanie obecności OA w lipoproteinach bogatych w triglicerydy (TRL). Chylomikrony zostaną najpierw wyizolowane z osocza w normalnej soli fizjologicznej przez wirowanie przy 100 000 x g przez 20 min. Lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL) będą następnie rozdzielane przy 230 000 x g przez 18 godzin. Frakcje chylomikronów i VLDL będą hydrolizowane enzymem trzustkowym. Uwolnione lipidy będą ekstrahowane mieszaniną chloroform:metanol (2:1) i frakcjonowane przez ekstrakcję ciało stałe/ciecz mieszaniną metanol:chloroform (1:1) i izopropanol:acetonitryl:woda (2:1:1). Skład wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) będzie analizowany metodą GC-FID jako odpowiednie estry metylowe. Możliwa obecność OA wśród lipidów pochodzących z TRL zostanie oceniona po frakcjonowaniu i analizie GC-MS. Zawartość apo B48 i B100, jako markerów obecności odpowiednio chylomikronów i VLDL, zostanie określona metodą ELISA.

Inne parametry biochemiczne insuliny w surowicy, peptydu C i GLP-1 będą analizowane metodą ELISA.