Biodisponibilidade do ácido oleanólico formulado como azeite funcional (BIO-OLTRAD)

Desenho e implementação dos ensaios de biodisponibilidade O estudo da biodisponibilidade oral do ácido oleanólico (AO) quando formulado como azeite funcional, e dos seus mecanismos de transporte sistémico, será abordado através de uma intervenção pós-prandial com 20 voluntários saudáveis.

Os participantes serão recrutados após as análises bioquímicas e hematológicas completas apresentarem resultados dentro dos limites da normalidade, e após verificação em seus históricos médicos eletrônicos de que não sofrem de distúrbios digestivos, metabólicos ou oncológicos ou qualquer outra patologia que, na opinião dos investigadores clínicos , poderia impedi-los de participar do julgamento. Para sua inclusão no ensaio, também é exigido que dêem o consentimento por escrito aos protocolos aprovados pelos Comitês Institucionais de Pesquisa em Seres Humanos, após terem sido convenientemente informados oralmente e documentalmente.

O trabalho de campo será realizado no Hospital Dia do Serviço de Endocrinologia e Nutrição dos Hospitais Universitários 'Virgen del Rocio' de Sevilha (ESPANHA).

Tamanho da amostra. A principal variável quantitativa a ser examinada neste estudo é a concentração sérica de OA. Na ausência de dados de linha de base consistentes publicados até o momento, foram usados ​​dados da análise de OA em soros do Estudo PREDIABOLE (ISRCTN03372660). Uma coorte de 25 participantes do grupo controle, consumindo azeite comercial, foi selecionada e uma concentração média de linha de base de 155 ± 72 ng OA/mL foi determinada. Considerando isso, postula-se agora que o teor plasmático de OA aumentará em pelo menos 50% como consequência da ingestão do azeite funcional (dose equivalente a 30 mg de OA). Para provar esse teste de hipótese unilateral, com um nível de confiança de 90% (risco α=0,01, zα=1,645) e um poder de 95% (zβ=1,645), é necessário um tamanho de amostra de pelo menos 17 voluntários. Assumindo que perdas inferiores a 15% são toleráveis, o tamanho amostral ajustado seria de 20 sujeitos.

Anamnese e exame físico dos participantes. A anamnese incluirá dados vitais e história geral coletando todos os sintomas que o indivíduo possa apresentar, sua história médica e cirúrgica, bem como os tratamentos farmacológicos seguidos. Também serão obtidas informações sobre estilo de vida, percepção da própria imagem corporal, alimentação e tipo e intensidade de atividade física. Além disso, serão examinadas a massa muscular, compartimento gorduroso (panículo adiposo), existência de edema, etc. Da mesma forma, serão determinadas a pressão arterial sistólica e diastólica e a frequência cardíaca.

Estudo antropométrico e composição corporal. O estudo antropométrico incluirá a determinação do peso corporal total, estatura, índice de massa corporal (IMC), bem como as circunferências da cintura e do quadril. O estudo e avaliação dessas variáveis ​​serão realizados de acordo com as diretrizes da International Society for the Advancement of kinanthropometry (ISAK). O estudo da composição corporal será realizado por bioimpedância elétrica, utilizando um analisador de composição corporal TANITA® modelo BC-418MA. A massa gorda, massa magra, massa muscular, água total, massa óssea, metabolismo basal e gordura visceral serão quantificados com esta técnica, fazendo uso de equações de predição validadas e ajustadas por idade e sexo.

Estudos bioquímicos. Amostras de sangue cubital em jejum serão colhidas para determinação dos parâmetros de bioquímica geral, hepática e renal. Além disso, será realizada uma análise completa de urina, que inclui as medições físicas, químicas e microscópicas habituais. Estas determinações serão realizadas no Laboratório de Análise e Bioquímica Clínica dos Hospitais Universitários 'Virgen del Rocío' de Sevilha.

Intervenção Os participantes serão incentivados a evitar o consumo de bebidas alcoólicas e tabaco no dia anterior à realização dos ensaios. Nos dias de teste, e após 12 horas de jejum noturno, amostras de sangue serão coletadas da veia cubital. Posteriormente, dez indivíduos selecionados aleatoriamente receberão 55 mL de azeite enriquecido com OA funcional (dose equivalente a 30 mg OA) como parte de um desjejum experimental, que inclui café, leite desnatado e torrada integral. Os outros dez participantes receberão dentro da refeição experimental a mesma quantidade do azeite de controle. Após a ingestão dos respectivos desjejuns, serão colhidas alíquotas de sangue cubital a cada hora, durante um período pós-prandial de 7 horas. Durante este período, será permitido o acesso gratuito à ingestão de água.

É estabelecido um período de washout de quatro semanas, após o qual será realizada uma nova série de testes que cruzam o tipo de azeite consumido.

Estudo farmacocinético da OA Das alíquotas de sangue cubital serão obtidos soros por centrifugação, sendo adicionados NaN3, PMSF e aprotinina como conservantes, para evitar sua degradação proteolítica. As amostras de soro serão armazenadas a -80 0C nos laboratórios do IG-CSIC até a análise. A extração e fracionamento do soro OA será realizada por extrações líquido/líquido e em fase sólida, enquanto a identificação e quantificação do triterpeno será completada por GC-FID e GC-MS. Na análise farmacocinética dos dados, será assumido um modelo monocompartimental. A partir dos dados dos teores séricos de OA livre ao longo do período pós-prandial serão determinados os seguintes parâmetros: 1) parâmetros de absorção como a concentração máxima alcançada e o tempo para isso, a constante de absorção e a área sob a curva; 2) parâmetros de distribuição como a constante e o volume de distribuição; 3) parâmetros do metabolismo, como a fração OA associada à albumina; e 4) parâmetros de eliminação como a constante de eliminação, a meia-vida e a depuração. Para os cálculos, será utilizado o módulo de análise farmacocinética SigmaPLot (Systat Software Inc., San Jose, CA, EUA).

Estudo da presença de OA em lipoproteínas ricas em triglicerídeos (TRL). Os quilomícrons serão primeiro isolados do plasma em solução salina normal por centrifugação a 100.000 × g por 20 min. As lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) serão subsequentemente separadas a 230.000 × g por 18 h. As frações quilomícrons e VLDL serão hidrolisadas com enzima pancreática. Os lipídios liberados serão extraídos com clorofórmio:metanol (2:1), e fracionados por extração sólido/líquido com metanol:clorofórmio (1:1) e isopropanol:acetonitrila:água (2:1:1). A composição de ácidos graxos livres (FFA) será analisada por GC-FID como os ésteres metílicos correspondentes. A possível presença de OA entre os lipídeos derivados de TRL será avaliada após fracionamento e análise por GC-MS. O conteúdo de apo B48 e B100, como marcadores da presença de quilomícrons e VLDL, respectivamente, será determinado por ELISA.

Outros parâmetros bioquímicos séricos de insulina, peptídeo C e GLP-1 serão analisados ​​por ELISA.