Rychlé měření adenosinu u pacientů se synkopou (BlotSpot)

Odůvodnění a cíl Až dosud byla překážkou širokého hodnocení adenosinu v klinické praxi obtížnost získat rychlá spolehlivá opatření. Vzhledem ke svému krátkému poločasu rozpadu v krvi není snadné odebírat a měřit adenosin. V době venepunkce se musí použít zastavovací roztok - nekomerčně dostupný - aby se inhibovala degradace adenosinu v tělesné tekutině. Po deproteinizaci plazmy je koncentrace adenosinu vyhodnocena pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie.

Nedávno byla vyvinuta rychlá metoda, která spočívá v měření koncentrace adenosinu v plné krvi namísto v plazmě pomocí hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS). Stručně řečeno, po propíchnutí prstu se odebere plná krev a kapka se nanese na savý papír (Whatman). Po extrakci adenosinu pomocí směsi sestávající z methanolu a vnitřního standardu se jeho koncentrace měří pomocí LC-MS/MS. Tato metoda je rychlá, dobře přijatelná pacientem, není drahá a snadno replikovatelná. Srovnání obou výše uvedených metod u 20 zdravých subjektů a pacientů s vazovagální synkopou ukázalo přijatelnou korelaci s r=0,65 a p<0,01. Průměrná koncentrace adenosinu byla významně vyšší u pacientů s vazovagální synkopou než u kontrol (3,1 uM versus 0,60 uM, p<0,001). Výše uvedené výsledky však musí být replikovány na větším vzorku pacientů a kontrol, než metoda měření adenosinu pomocí blotového papíru může nahradit standardní metodu.

V této studii chceme zhodnotit plazmatické hladiny adenosinu u větší neselektované kohorty pacientů postižených nekardiální synkopou a porovnat výsledky se zdravými kontrolami.

Design studie Chceme posoudit rychlý způsob dávkování adenosinu do plné krve u pacientů se synkopou au kontrol. Studie bude provedena u pacientů odeslaných do Istituto Auxologico Italiano. Vzorek krve bude odeslán do Laboratoře biochemie, Timone Hospital 264 Rue Saint-Pierre, 13385 Marseille, Francie k analýze Skupina synkopy: pacienti odeslaní na oddělení synkopy of Auxologico s diagnózou možné nebo určité reflexní synkopy (diagnostická třída I. kritéria ESC guidelines) po vyloučení konkurenčních diagnóz.

Pacienti se synkopou jsou rozděleni do 3 předem definovaných podskupin:

• Podskupina A) Pacienti bez prodromů nebo velmi krátkých prodromů (5 sekund), normální srdce a normální EKG
• Podskupina B) Pacienti s typickými vazovagálními rysy (ortostatické nebo emoční spouštěče, dlouhé prodromy se známkami a příznaky autonomní aktivace, tj. nevolnost, pocení, závratě, bledost)
• Podskupina C) Pacienti, kteří nepatří do žádné z výše uvedených podskupin.

Skupina bez synkopy: 1) Pacienti bez synkopy v anamnéze, doporučení Auxologico z jiných důvodů; tito pacienti nemají žádné závažné strukturální onemocnění srdce a další komorbidity. 2) Zdraví dobrovolníci vybraní z personálu Auxologico. Výběr těchto pacientů bude proveden tak, aby odpovídaly případům synkopy podle věku a pohlaví.

Odběr krevních vzorků Celá krev se odebere punkcí z prstu a poté se kapka krve (20 μl) nanese pomocí finnpipety na savý papír (Whatman 903 protein saver cards™) a suší se přes noc při pokojové teplotě, aby se získala vysušená krevní skvrna (DBS ).

Extrakce krevních vzorků Šest milimetrů vysušené krevní skvrny (DBS) se vyřízne a následuje extrakce směsí skládající se z methanolu (400 μl) a vnitřního standardu (50 μl) ve 2ml mikrocentrifugačních zkumavkách a poté míchána po dobu 90 minut při 45 °C. Po extrakci se alikvot 350 μl přenese do nové 2ml zkumavky s bezpečným zámkem a odpaří se do sucha při 60 °C pod dusíkem, přidá se 150 μl 0,1% kyseliny mravenčí ve vodě a rychle se promíchá před převedením do HPLC. lahvička s automatickým vzorkovačem.

Dávkování adenosinu Po extrakci adenosinu pomocí směsi skládající se z methanolu a vnitřního standardu se jeho koncentrace měří pomocí LC-MS/MS.

Vzorky jsou analyzovány pomocí systému Shimadzu UFLC XR sestávajícího ze dvou binárních čerpadel LC-20ADXR, vakuového odplyňovače DGU-20A5R a termostatované kolonové pece CT0-20AC a automatického vzorkovače chlazeného SIL-20ACXR (Shimadzu, Marne la Vallee, Francie) . LC systém byl propojen s trojitým kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem ABSciex 4500 (Les Ulis, Francie) pracujícím se zdrojem elektrosprejové ionizace (ESI) za použití dusíku (čistota: 99,99 %). Deset mikrolitrů extrahovaného vzorku bylo nastříknuto na kolonu AtlantisR T3 2,1 × 100 mm, 3 μm, Waters (Guyancourt, Francie). Výchozí mobilní fáze sestávala ze 3 % methanolu a 97 % okyselené vody (0,1 % kyseliny mravenčí) s průtokem 0,7 ml/min po dobu 3,5 min. Poté byl gradient methanolu zvýšen na 30 % po dobu 3 minut. Kolona byla znovu ekvilibrována po dobu 2 minut na výchozí podmínky.