Misurazione rapida dell'adenosina nei pazienti con sincope (BlotSpot)

Razionale e obiettivo Fino ad ora, un ostacolo alla valutazione diffusa dell'adenosina nella pratica clinica è stata la difficoltà di ottenere misure rapide e affidabili. Infatti, a causa della sua breve emivita nel sangue, l'adenosina non è facile da campionare e misurare. Al momento della venipuntura, deve essere utilizzata una soluzione di arresto - non disponibile in commercio - per inibire la degradazione dell'adenosina nel fluido corporeo. Dopo la deproteinizzazione del plasma, la concentrazione di adenosina viene valutata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione.

Recentemente è stato sviluppato un metodo rapido che consiste nel misurare la concentrazione di adenosina nel sangue intero invece che nel plasma mediante spettrometria di massa (LC-MS/MS). In breve, il sangue intero viene raccolto dopo la puntura del dito e una goccia viene depositata su una carta assorbente (Whatman). Dopo l'estrazione dell'adenosina mediante una miscela costituita da metanolo e standard interno, se ne misura la concentrazione mediante LC-MS/MS. Questo metodo è rapido, ben accettato dal paziente, non costoso e facilmente replicabile. Il confronto tra le due metodiche sopra citate in 20 soggetti sani e in pazienti con sincope vasovagale ha mostrato una correlazione accettabile, con r=0.65 e p<0.01. La concentrazione media di adenosina era significativamente più alta nei pazienti con sincope vasovagale rispetto ai controlli (3,1 µM contro 0,60 µM, p<0,001). Tuttavia, i risultati di cui sopra devono essere replicati in un campione più ampio di pazienti e controlli prima che il metodo di misurazione dell'adenosina su carta assorbente possa sostituire il metodo standard.

In questo studio vogliamo valutare i livelli plasmatici di adenosina in una più ampia coorte non selezionata di pazienti affetti da sincope non cardiaca e confrontare i risultati con controlli sani.

Disegno dello studio Vogliamo valutare il metodo rapido di dosaggio dell'adenosina nel sangue intero nei pazienti con sincope e nei controlli. Lo studio sarà condotto su pazienti afferenti all'Istituto Auxologico Italiano. Il campione di sangue verrà inviato per l'analisi al Laboratorio di Biochimica, Ospedale Timone 264 Rue Saint-Pierre, 13385 Marsiglia, Francia Gruppo sincope: pazienti inviati all'Unità sincope di Auxologico con diagnosi di possibile o certa sincope riflessa (diagnostica di classe I criteri delle linee guida ESC) dopo l'esclusione delle diagnosi concorrenti.

I pazienti con sincope sono suddivisi in 3 sottogruppi predefiniti:

• Sottogruppo A) Pazienti senza prodromi o con prodromi molto brevi (5 sec), cuore normale ed ECG normale
• Sottogruppo B) Pazienti con tipiche caratteristiche vasovagali (trigger ortostatici o emotivi, lunghi prodromi con segni e sintomi di attivazione autonomica, cioè nausea, sudorazione, vertigini, pallore)
• Sottogruppo C) Pazienti che non appartengono a nessuno dei suddetti sottogruppi.

Gruppo senza sincope: 1) Pazienti senza storia di sincope, indirizzati ad Auxologico per altri motivi; questi pazienti hanno l'assenza di cardiopatie strutturali gravi e altre comorbilità. 2) Volontari sani selezionati tra il personale di Auxologico. La selezione di questi pazienti sarà effettuata abbinandoli ai casi di sincope per età e sesso.

Raccolta di campioni di sangue Il sangue intero viene raccolto mediante puntura del dito, seguito dal deposito di una goccia di sangue (20 μL) mediante finnpipette, su carta assorbente (Whatman 903 protein saver card™) e asciugato durante la notte a temperatura ambiente per ottenere una macchia di sangue essiccato (DBS ).

Estrazione dei campioni di sangue Vengono prelevati sei millimetri di macchia di sangue essiccato (DBS), seguiti dall'estrazione con una miscela composta da metanolo (400 μl) e standard interno (50 μl) in provette per microcentrifuga da 2 mL, quindi miscelati per 90 minuti a 45°C. Dopo l'estrazione, un'aliquota di 350 μL viene trasferita in una nuova provetta con chiusura di sicurezza da 2 ml ed evaporata a secchezza a 60°C sotto azoto, vengono aggiunti 150 μl di acido formico allo 0,1% in acqua e agitati rapidamente prima del trasferimento in HPLC fiala del campionatore automatico.

Dosaggio dell'adenosina Dopo l'estrazione dell'adenosina mediante una miscela costituita da metanolo e standard interno, se ne misura la concentrazione mediante LC-MS/MS.

I campioni vengono analizzati utilizzando un sistema Shimadzu UFLC XR costituito da due pompe binarie LC-20ADXR, un sistema di degasaggio sottovuoto DGU-20A5R, un forno a colonna termostatato CT0-20AC e un campionatore automatico raffreddato SIL-20ACXR (Shimadzu, Marne la Vallee, Francia) . Il sistema LC è stato interfacciato con uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo ABSciex 4500 (Les Ulis, Francia) operante con una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) che utilizza azoto (purezza: 99,99%). Dieci microlitri del campione estratto sono stati iniettati su una colonna AtlantisR T3 da 2,1 × 100 mm, 3 μm, Waters (Guyancourt, Francia). La fase mobile iniziale consisteva di 3% di metanolo e 97% di acqua acidificata (0,1% di acido formico) con un flusso di 0,7 ml/min per 3,5 min. Quindi, il gradiente di metanolo è stato aumentato al 30% per 3 minuti. La colonna è stata riequilibrata per 2 minuti alle condizioni iniziali.