Glykoxidace, arteriální biomechanika a poškození cílových orgánů (GlycOxiTOD)

ÚVOD

Aterosklerotické kardiovaskulární onemocnění (ASCVD) představuje jednu z hlavních příčin morbidity a mortality v populaci. Arteriální hypertenze (AHT) spolu s dalšími kardiovaskulárními rizikovými faktory (CVR) predisponuje k abnormalitám ve struktuře a funkci velkých a malých tepen, což vede k předčasnému vaskulárnímu stárnutí a kulminuje v rozvoji poškození cílových orgánů (TOD). jasný, ale nedostatečně diagnostikovaný prekurzor ASCVD. Ne u všech pacientů se však TOD rozvine, ani se tak nestane ve stejném časovém období nebo se stejnou intenzitou. Navíc pacienti, u nichž se zpočátku projevila nízká až střední CVR, jsou již považováni za pacienty se střední až vysokou CVR v přítomnosti TOD s přísnějšími terapeutickými cíli [1,2].

Cévní biomechanika se primárně zaměřuje na studium mechanických vlastností a chování tepen. Nepříznivá arteriální biomechanika je spojena s rozvojem a progresí aterosklerózy a arteriosklerózy. Tyto procesy představují kontinuum vaskulárního poškození zprostředkovaného akumulací oxidovaných lipoproteinů v subendoteliálním prostoru, aktivací a amplifikací zánětlivých drah a rozvojem arteriální fibrózy a kalcifikace. Jádrem těchto jevů je výskyt endoteliální dysfunkce, charakterizované zvýšenou permeabilitou a ztrátou filtrační kapacity vaskulárního endotelu pro škodlivé molekuly do arteriální stěny [3,4].

Oxidační stres, definovaný jako nerovnováha mezi produkcí reaktivních druhů a antioxidačními systémy ve prospěch prvních, hraje klíčovou roli ve vývoji endoteliální dysfunkce, ukládání oxidovaných lipoproteinů a prozánětlivé interakci mezi nimi a mononukleárně-fagocytárním systémem. Akumulace reaktivních forem kyslíku (ROS) a dalších indukuje jevy peroxidace lipidů a glykooxidace, které kulminují tvorbou pokročilých konečných produktů lipoxidace a glykace (ALE a AGE). ALE a AGE se mohou vázat na proteiny, způsobovat funkční a strukturální abnormality a také ovlivňovat buněčnou signalizaci mimo jiné aktivací cest smrti [5,6].

Nepříznivý redoxní stav a hladiny glykace jsou spojeny se stárnutím, degenerativními onemocněními a akumulovaným poškozením cév u některých subpopulací, zejména pacientů s diabetes mellitus (DM). O vlivu glykace a glykooxidace antioxidačního systému na arteriální biomechaniku a rozvoj poškození cílových orgánů u zdánlivě zdravých pacientů se střední až vysokou CVR je však známo jen málo. Naším cílem je studovat specifický vztah mezi arteriálními biomechanickými abnormalitami a TOD s hladinami glykace v séru, stavem glykooxidace a rovnováhou funkce a struktury některých prvků antioxidačního systému, se zdůrazněním katalázy, superoxiddismutázy a glutathionperoxidázy [4,7,8].

MATERIÁLY A METODY

Návrh a nastavení projektu

Jedná se o observační, ambispektivní a multicentrický projekt podporovaný oddělením hypertenze a kardiovaskulárního rizika interního oddělení Fakultní nemocnice v Santiagu de Compostela. Kandidátskými pacienty budou jedinci patřící do Organizační struktury integrovaného managementu (EOXI) v Santiagu de Compostela a Barbanza, kteří vyhledávají konzultace ohledně diagnostiky kardiovaskulárního rizika, managementu a sledování [9].

Účastníci. Kritéria zahrnutí a vyloučení

Z celkového souboru konzultovaných pacientů budou předem vybráni pouze jedinci starší 18 let se středním až vysokým profilem kardiovaskulárního rizika CVR na základě referenčních skóre doporučení. Kritéria pro vyloučení budou zahrnovat přítomnost DM podle současných doporučení pro klinickou praxi, kuřácký návyk (definovaný jako současná spotřeba a během 6 měsíců před náborem), riziková konzumace alkoholu (definovaná jako spotřeba přesahující 10 g a 20 g denně u žen a mužů a prokázaným kardiovaskulárním onemocněním [10–14].

Hodnocení arteriálních biomechanických markerů a TOD

Provedeme oboustranné ultrazvukové vyšetření společné krkavice (CCA), vnitřní krkavice (ICA) a distálních tepen dolních končetin pomocí přístroje Mindray Z60 (Mindray®, Guangdong, Čína) s vysokofrekvenční sondou. Budou extrahována následující měření a výpočty:

1. V pohybovém módu (M-mode) současné měření arteriálního poloměru, arteriálních tlaků a celkové tloušťky stěny pro výpočet parametrů roztažnosti a napětí ve středním segmentu CCA [15,16].
2. Ve dvourozměrném režimu (B-mode) automatizované měření tloušťky intima-media (IMT) v distální oblasti CCA spolu s detekcí a charakterizací cholesterolového plaku[17].
3. Ve spektrálním dopplerovském módu morfologický popis objemově-časové (průtokové) funkce z hlediska průtokových rychlostí a indexů vaskulárního odporu ve středním segmentu CCA a ICA [18].
4. V B-módu s elastografickým modulem přímé vyhodnocení stupně lokální tuhosti ve středním segmentu CCA [19].
5. Ve spektrálním dopplerovském módu se synchronizací EKG hodnocení rychlosti karoticko-femorální pulzní vlny (c-f PWV) [20].
6. Ve spektrálním dopplerovském módu hodnocení kotník-pažního indexu (ABI) [21].

Rovněž posoudíme počínající poškození v retinální mikrovaskulatuře pomocí retinografie na přístroji Topcon TRC-NW6S (Electronics®, Tokyo, Japonsko).

Hodnocení markerů oxidačního stresu a struktury aktivity antioxidačního systému

K posouzení redoxního stavu budou stanoveny hladiny oxidace lipidů (peroxidace lipidů) a proteinů v plazmě a moči kvantifikací látek reaktivních s thiobarbiturovou kyselinou (TBARS) a redukovaných thiolů podle referenčních protokolů [22,23]. Obě metody umožňují kvantifikaci pomocí spektrofotometrických metod. Analýzy budou prováděny pomocí analyzátoru Asys UVM-340 (Biochrom®, Cambridge, UK). Enzymatická funkce glutathionperoxidázy, katalázy a superoxiddismutázy bude měřena jako enzymatická aktivita pomocí analyzátoru Asys UVM-340 (Biochrom®, Cambridge, UK) podle uvedených protokolů [24,25]. Strukturní rysy antioxidačních enzymů založených na glykaci a glykoxidaci budou hodnoceny pomocí proteomiky včetně SDS-PAGE, chromatografie a hmotnostní spektrometrie [26-28].

Stanovení glykačního a glykooxidačního stavu

Procento glykovaného hemoglobinu bude hodnoceno pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s analyzátorem Hemoglobin next (A. Menarini Diagnostics®, Florencie, Itálie). Hladiny fruktosaminu budou stanoveny enzymatickou metodou s diazymem glykovaným sérovým proteinem (Diazyme, Kent, UK) na analyzátoru Advia 2400 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.®, Tarrytown, USA). Procento glykovaného albuminu bude odhadnuto z hladin fruktosaminu a albuminu [29,30]. Toto laboratorní posouzení bude provádět oddělení Laboratoře ÚVN.

Obecné hladiny glykoxidace budou kvantifikovány stanovením konečných produktů pokročilé glykace (AGE) v kůži pomocí AGE Reader (DiagnOptics BV®, Groningen, Nizozemsko). AGE představují především glykované adukty vázané na proteiny, které vznikají během glykooxidačních procesů. AGE Reader byl vyvinut pro neinvazivní hodnocení kožní autofluorescence (SAF) pomocí fluorescenčních vlastností různých AGE [31].

Výsledky v kardiovaskulárním riziku

Budeme měřit počet potřebných k léčbě (NNT) konzultací a dobu průzkumu, abychom odhalili abnormality v arteriální biomechanice a poškození cílových orgánů (TOD), a tak určili zvýšenou CVR zaručující terapeutickou intenzifikaci. Posouzeny budou také kardiovaskulární a cerebrovaskulární příhody, hospitalizace, konzultace, úmrtí a invalidita [32].

Etické úvahy a správná klinická praxe

Tato studie bude provedena v souladu s etickými zásadami Helsinské deklarace a se standardy dobré praxe ve výzkumu Galicijského (Španělského) zdravotnictví (SERGAS). Od všech pacientů, kteří souhlasili s účastí, bude získán písemný informovaný souhlas. Protokoly byly schváleny Etickým výborem pro výzkum v Santiago-Lugo (kódy 2021/401 a 2023/302).

Pracovní plán a tok projektu

V první fázi plánujeme zahrnout pacienty, kteří splňují kritéria a souhlasí s účastí. Klinicko-antropometrické hodnocení, arteriální biomechanika, detekce TOD a odběr vzorků budou provedeny v jediném lékařském úkonu. U pacientů s biomechanickými abnormalitami a arteriální TOD i bez nich budou kvantifikovány markery biomechanického, oxidačního stresu, glykace a glykoxidace. Cílem této fáze je vyhodnotit rozdíly mezi skupinami pacientů na základě biomechanických parametrů a arteriálního TOD. U podskupiny pacientů budou také hodnoceny rozdíly ve struktuře-funkci antioxidačních enzymů z hlediska hladiny glykace a glykooxidace a jejich vztah k arteriálním biomechanickým abnormalitám a TOD. Tato fáze bude zahrnovat extrakci, sběr, zpracování a analýzu předběžných dat spolu s dosažením počátečních výsledků projektu.

Ve druhé fázi,

1. Pacienti bez biomechanických abnormalit nebo TOD podstoupí 5leté sledování s každoročním a konečným hodnocením biomechanických abnormalit, TOD a kardiovaskulárních výsledků. Cílem této fáze je vyhodnotit rozdíly v předchozích markerech mezi skupinami pacientů na základě biomechanických parametrů a arteriálního TOD. U podskupiny pacientů budou také hodnoceny rozdíly ve struktuře-funkci antioxidačních enzymů z hlediska hladiny glykace a glykooxidace a jejich vztah k arteriálním biomechanickým abnormalitám a TOD. Tato fáze bude zahrnovat extrakci, sběr, zpracování a analýzu předběžných dat spolu s dosažením konečných výsledků projektu.
2. Pacienti s biomechanickými abnormalitami a/nebo TOD podstoupí 5leté sledování s každoročním a konečným hodnocením progrese TOD a kardiovaskulárních výsledků. Cílem této fáze je vyhodnotit rozdíly v předchozích markerech mezi skupinami pacientů na základě arteriálního TOD a kardiovaskulárních výsledků. V podskupině pacientů budou hodnoceny rozdíly ve struktuře-funkci antioxidačních enzymů z hlediska hladin glykace a glykooxidace a jejich vztah k TOD a kardiovaskulárním výsledkům. Tato fáze bude zahrnovat extrakci, sběr, zpracování a analýzu předběžných dat spolu s dosažením konečných výsledků projektu.

Matematická analýza a modelování

Bude použit statistický softwarový balík SPSS 22.0 (SPSS Inc.®, Chicago, IL, EE.UU). Bude proveden deskriptivní statistický přístup, včetně posouzení normality pro kvantitativní proměnné. Jednorozměrné statistiky budou použity k porovnání skupin se specifickými testy v závislosti na typu proměnné. Pokud budou nalezeny relevantní výsledky, budou provedeny lineární korelační studie. Po jednorozměrné analýze budou zkonstruovány vícerozměrné modely, jak vysvětlující pro asociaci prediktorů s výsledky, tak prediktivní pro riziko biomechanických abnormalit, TOD a kardiovaskulárních výsledků. K posouzení faktorů, které mohou ovlivnit biomechanické parametry, TOD a kardiovaskulární výsledky v čase, budou použity specifické matematické postupy související s přístupem společného modelování a analýzou časových řad. Výpočty velikosti vzorku budou založeny na specifických statistických testech podle typu a distribuce proměnné, vždy s ohledem na střední velikost účinku, 95% interval spolehlivosti (95%CI) a alespoň 80% sílu [33-35].

REFERENCE

1. Wang MC, Lloyd-Jones DM. Hodnocení kardiovaskulárního rizika u pacientů s hypertenzí. Am J Hypertens 2021;34:569-77. https://doi.org/10.1093/ajh/hpab021.
2. Piskorz D. Hypertenze zprostředkované poškození orgánů a léčba hypertenze. Jak posoudit příznivé účinky antihypertenzní léčby? High Blood Press Cardiovasc Předcházející 2020;27:9-17. https://doi.org/10.1007/s40292-020-00361-6.
3. Simon BR, Kaufmann MV, McAfee MA, Baldwin AL. Modely konečných prvků pro mechaniku arteriálních stěn. J Biomech Eng 1993;115:489-96. https://doi.org/10.1115/1.2895529.
4. Guzik TJ, Touyz RM. Oxidační stres, záněty a vaskulární stárnutí u hypertenze. Hypertenze 2017;70:660-7. https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.117.07802.
5. Vistoli G, De Maddis D, Cipak A, Zarkovic N, Carini M, Aldini G. Konečné produkty pokročilé glykooxidace a lipoxidace (AGE a ALE): přehled mechanismů jejich tvorby. Free Radic Res 2013;47 Suppl 1:3-27. https://doi.org/10.3109/10715762.2013.815348.
6. Gianazza E, Brioschi M, Fernandez AM, Banfi C. Lipoxidace u kardiovaskulárních onemocnění. Redox Biol 2019;23:101119. https://doi.org/10.1016/j.redox.2019.101119.
7. Al-Kuraishy HM, Sami OM, Hussain NR, Al-Gareeb AI. Metformin a/nebo vildagliptin zmírňují oxidační stres vyvolaný diabetes mellitus II. typu: Zajímavý účinek. J Adv Pharm Technol Res 2020;11:142-7. https://doi.org/10.4103/japtr.JAPTR_18_20.
8. poslanec Mattson. Role produktu peroxidace lipidů 4-hydroxynonenalu u obezity, metabolického syndromu a souvisejících vaskulárních a neurodegenerativních poruch. Exp Gerontol 2009;44:625-33. https://doi.org/10.1016/j.exger.2009.07.003.
9. Hospital Clínico Universitario de Santiago - Área Sanitaria de Santiago de Compostela y Barbanza (Hospitales, Centros de Salud, Casas del Mar y Consultorios) n.d. https://xxisantiago.sergas.es/Paxinas/web.aspx?tipo=paxtab&idLista=3&idContido=183&migtab=174%3B183&idioma=es (přístup 12. března 2024).
10. Viseren FLJ, Mach F, Smulders YM, Carballo D, Koskinas KC, Bäck M a kol. 2021 ESC Guidelines o prevenci kardiovaskulárních onemocnění v klinické praxi. Eur Heart J 2021;42:3227-337. https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehab484.
11. Briasoulis A, Agarwal V, Messerli FH. Spotřeba alkoholu a riziko hypertenze u mužů a žen: systematický přehled a metaanalýza. J Clin Hypertens (Greenwich) 2012;14:792-8. https://doi.org/10.1111/jch.12008.
12. Amos A, Greaves L, Nichter M, Bloch M. Ženy a tabák: výzva k zahrnutí pohlaví do výzkumu, politiky a praxe kontroly tabáku. Kontrola tabáku 2012;21:236-43. https://doi.org/10.1136/tobaccocontrol-2011-050280.
13. ElSayed NA, Aleppo G, Aroda VR, Bannuru RR, Brown FM, Bruemmer D a kol. 2. Klasifikace a diagnostika diabetu: Standardy péče o diabetes-2023. Diabetes Care 2023;46:S19-40. https://doi.org/10.2337/dc23-S002.
14. Autoři/Členové pracovní skupiny:, McDonagh TA, Metra M, Adamo M, Gardner RS, Baumbach A, et al. 2021 Směrnice ESC pro diagnostiku a léčbu akutního a chronického srdečního selhání: Vyvinuto pracovní skupinou pro diagnostiku a léčbu akutního a chronického srdečního selhání Evropské kardiologické společnosti (ESC). Se zvláštním přispěním Asociace srdečního selhání (HFA) ESC. Eur J Heart Fail 2022;24:4-131. https://doi.org/10.1002/ejhf.2333.
15. Bozkurt Yılmaz HE, Yılmaz M. Hodnocení roztažnosti a elasticity karotid u pacientů s astmatem. Iran J Allergy Asthma Immunol 2021;20:279-86. https://doi.org/10.18502/ijaai.v20i3.6329.
16. Kane JW, Sternheim MM. Física. Reverte; 1989.
17. Molinari F, Zeng G, Suri JS. Přehled současného stavu techniky měření tloušťky intima-media (IMT) a technik segmentace stěny pro ultrazvuk karotid. Programy výpočetních metod Biomed 2010;100:201-21. https://doi.org/10.1016/j.cmpb.2010.04.007.
18. Andrikou I, Tsioufis C, Konstantinidis D, Kasiakogias A, Dimitriadis K, Leontsinis I, et al. Renální odporový index u hypertoniků. J Clin Hypertens (Greenwich) 2018;20:1739-44. https://doi.org/10.1111/jch.13410.
19. Ultrazvuková elastografie: Přehled technik a klinických aplikací - PubMed n.d. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28435467/ (přístup 12. března 2024).
20. Ji H, Xiong J, Yu S, Chi C, Bai B, Teliewubai J a kol. Měření rychlosti tepové vlny mezi karotidou a femorálním tepem (Cf-PWV) za účelem vyhodnocení tuhosti tepen. J Vis Exp 2018:57083. https://doi.org/10.3791/57083.
21. Zwakenberg SR, de Jong PA, Hendriks EJ, Westerink J, Spiering W, de Borst GJ a kol. Intimální a mediální kalcifikace ve vztahu ke kardiovaskulárním rizikovým faktorům. PLoS One 2020;15:e0235228. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235228.
22. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Test na peroxidy lipidů v živočišných tkáních reakcí s kyselinou thiobarbiturovou. Anal Biochem 1979;95:351-8. https://doi.org/10.1016/0003-2697(79)90738-3.
23. Ellman GL. Tkáňové sulfhydrylové skupiny. Arch Biochem Biophys 1959;82:70-7. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6.
24. Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzymol 1984;105:121-6. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(84)05016-3.
25. Flohé L, Günzler WA. Stanovení glutathionperoxidázy. Methods Enzymol 1984;105:114-21. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(84)05015-1.
26. Kwas M, Bucholc B, Slusarczyk J. [Použití elektroforézy v polyakrylomidovém gelu (SDS_PAGE) pro hodnocení struktury IgG – hlavní složka lidského intravenózního imunoglobulinu]. Med Dosw Mikrobiol 2000;52:301-9.
27. Chaila MZ, Viniegra M, Gagliardino JJ, Martínez A, Simesen de Bielke MG, Frusti M a kol. Měření glykovaného hemoglobinu: Porovnání tří metod versus vysoce výkonná kapalinová chromatografie. J Diabetes Sci Technol 2022;16:724-31. https://doi.org/10.1177/1932296821997179.
28. van Schaick G, Pot S, Schouten O, den Hartog J, Akeroyd M, van der Hoeven R, et al. Hodnocení vlivu glykace na lipázovou aktivitu pomocí boronátové afinitní chromatografie a hmotnostní spektrometrie. Food Chem 2023;421:136147. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.136147.
29. Hoelzel W, Weykamp C, Jeppsson J-O, Miedema K, Barr JR, Goodall I, et al. Referenční systém IFCC pro měření hemoglobinu A1c v lidské krvi a národní standardizační schémata ve Spojených státech, Japonsku a Švédsku: srovnávací studie metod. Clin Chem 2004;50:166-74. https://doi.org/10.1373/clinchem.2003.024802.
30. Wu W-C, Ma W-Y, Wei J-N, Yu T-Y, Lin M-S, Shih S-R a kol. Glykovaný albumin v séru jako vodítko pro diagnostiku diabetu melitus. PLoS One 2016;11:e0146780. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146780.
31. Atzeni IM, van de Zande SC, Westra J, Zwerver J, Smit AJ, Mulder DJ. The AGE Reader: Neinvazivní metoda k posouzení dlouhodobého poškození tkání. Methods 2022;203:533-41. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.02.016.
32. Wolff G, Lin Y, Akbulut C, Brockmeyer M, Parco C, Hoss A a kol. Meta-analyzovaná čísla potřebná k léčbě nových antidiabetik pro kardiovaskulární výsledky. ESC Heart Fail 2023;10:552-67. https://doi.org/10.1002/ehf2.14213.
33. Diaz-Louzao C, Barrera-Lopez L, Lopez-Rodriguez M, Casar C, Vazquez-Agra N, Pernas-Pardavila H a kol. Podélný vztah poškození jater s biomarkery zánětu u hospitalizovaných pacientů s COVID-19 pomocí přístupu modelování kloubů. Sci Rep 2022;12:5547. https://doi.org/10.1038/s41598-022-09290-x.
34. Malone HE, Nicholl H, Coyne I. Základy odhadu velikosti vzorku. Sestra Res 2016;23:21-5. https://doi.org/10.7748/nr.23.5.21.s5.
35. Cohen J. Statistická analýza síly pro behaviorální vědy. 2. vyd. New York: Routledge; 1988. https://doi.org/10.4324/9780203771587.