Glikoksydacja, biomechanika tętnic i uszkodzenie narządów docelowych (GlycOxiTOD)

WSTĘP

Miażdżycowa choroba układu krążenia (ASCVD) stanowi jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności w populacji. Nadciśnienie tętnicze (AHT) wraz z innymi czynnikami ryzyka sercowo-naczyniowego (CVR) predysponuje do nieprawidłowości w budowie i funkcjonowaniu dużych i małych tętnic, prowadząc do przedwczesnego starzenia się naczyń i kończąc na rozwoju uszkodzenia narządów docelowych (TOD), co objawia się wyraźny, ale niezdiagnozowany prekursor ASCVD. Jednakże nie u wszystkich pacjentów rozwija się TOD, nie dzieje się tak w tym samym czasie i z taką samą intensywnością. Ponadto pacjentów, u których początkowo występuje niska lub umiarkowana CVR, uważa się już za pacjentów z umiarkowaną lub wysoką CVR w obecności TOD, z bardziej rygorystycznymi celami terapeutycznymi [1,2].

Biomechanika naczyń koncentruje się przede wszystkim na badaniu właściwości mechanicznych i zachowania tętnic. Niekorzystna biomechanika tętnic jest związana z rozwojem i postępem miażdżycy i arteriosklerozy. Procesy te reprezentują kontinuum uszkodzeń naczyń, w których pośredniczy akumulacja utlenionych lipoprotein w przestrzeni podśródbłonkowej, aktywacja i wzmocnienie szlaków zapalnych oraz rozwój zwłóknienia i zwapnienia tętnic. U podstaw tych zjawisk leży występowanie dysfunkcji śródbłonka, charakteryzującej się zwiększoną przepuszczalnością i utratą zdolności śródbłonka naczyniowego do filtrowania szkodliwych cząsteczek do ściany tętnicy [3,4].

Stres oksydacyjny, definiowany jako brak równowagi między wytwarzaniem reaktywnych gatunków a układami antyoksydacyjnymi na korzyść tego pierwszego, odgrywa kluczową rolę w rozwoju dysfunkcji śródbłonka, odkładaniu się utlenionych lipoprotein i prozapalnych interakcji między nimi a układem jednojądrzasto-fagocytarnym. Nagromadzenie reaktywnych form tlenu (ROS) i innych indukuje zjawiska peroksydacji i glikooksydacji lipidów, których kulminacją jest tworzenie zaawansowanych końcowych produktów lipoksydacji i glikacji (odpowiednio ALE i AGE). ALE i AGE mogą wiązać się z białkami, powodując nieprawidłowości funkcjonalne i strukturalne, a także wpływać na sygnalizację komórkową poprzez aktywację m.in. szlaków śmierci [5,6].

Niekorzystny stan redoks i poziomy glikacji są powiązane ze starzeniem się, chorobami zwyrodnieniowymi i nagromadzonymi uszkodzeniami naczyń w niektórych subpopulacjach, zwłaszcza u pacjentów z cukrzycą (DM). Niewiele jednak wiadomo na temat wpływu glikacji i glikooksydacji układu antyoksydacyjnego na biomechanikę tętnic i rozwój uszkodzeń narządów docelowych u pozornie zdrowych pacjentów z umiarkowaną do wysokiej CVR. Naszym celem jest zbadanie specyficznego związku między nieprawidłowościami biomechanicznymi tętnic i TOD a poziomem glikacji w surowicy, stanem glikooksydacji i równowagą funkcjonalno-strukturalną niektórych elementów układu antyoksydacyjnego, ze szczególnym uwzględnieniem katalazy, dysmutazy ponadtlenkowej i peroksydazy glutationowej [4,7,8].

MATERIAŁY I METODY

Projekt i konfiguracja projektu

Jest to projekt obserwacyjny, ambispektywny i wieloośrodkowy, którego organizatorem jest Oddział Nadciśnienia Tętniczego i Ryzyka Sercowo-Naczyniowego należący do Oddziału Chorób Wewnętrznych Szpitala Uniwersyteckiego w Santiago de Compostela. Kandydatami na pacjentów będą osoby należące do Struktury Organizacyjnej Zintegrowanego Zarządzania (EOXI) w Santiago de Compostela i Barbanza, które zgłaszają się na konsultację w celu diagnozy ryzyka sercowo-naczyniowego, leczenia i obserwacji [9].

Uczestnicy. Kryteria włączenia i wyłączenia

Z całkowitej puli pacjentów, z którymi się konsultowano, zostaną wstępnie wybrane wyłącznie osoby w wieku powyżej 18 lat z umiarkowanym do wysokiego profilem ryzyka sercowo-naczyniowego CVR na podstawie punktacji referencyjnej wytycznych. Kryteria wykluczenia będą obejmowały obecność cukrzycy zgodnie z aktualnymi wytycznymi praktyki klinicznej, nałóg palenia (definiowany jako bieżące spożycie oraz w ciągu 6 miesięcy przed rekrutacją), ryzykowne spożycie alkoholu (definiowane jako spożycie przekraczające 10 g i 20 g dziennie dla kobiet i mężczyzn odpowiednio) i stwierdzoną chorobę sercowo-naczyniową [10-14].

Ocena tętniczych markerów biomechanicznych i TOD

Przeprowadzimy obustronną eksplorację ultrasonograficzną tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) i tętnic dystalnych kończyn dolnych za pomocą urządzenia Mindray Z60 (Mindray®, Guangdong, Chiny) z sondą wysokiej częstotliwości. Zostaną wyodrębnione następujące pomiary i obliczenia:

1. W trybie ruchu (tryb M) jednoczesny pomiar promienia tętnicy, ciśnienia tętniczego i całkowitej grubości ścianki w celu obliczenia parametrów rozciągliwości i napięcia w środkowym odcinku CCA [15,16].
2. W trybie dwuwymiarowym (tryb B) zautomatyzowany pomiar grubości błony wewnętrznej i środkowej (IMT) w dystalnym obszarze CCA wraz z wykrywaniem i charakteryzacją płytki cholesterolowej [17].
3. W spektralnym trybie Dopplera morfologiczny opis funkcji objętość-czas (przepływ) w zakresie prędkości przepływu i wskaźników oporu naczyniowego w środkowym odcinku CCA i ICA [18].
4. W trybie B z modułem elastograficznym bezpośrednia ocena stopnia miejscowej sztywności w środkowym odcinku CCA [19].
5. W trybie spektralnego Dopplera z synchronizacją EKG ocena prędkości fali tętna szyjno-udowego (c-f PWV) [20].
6. W widmowym trybie Dopplera ocena wskaźnika kostka–ramię (ABI) [21].

Ocenimy również początkowe uszkodzenia mikrokrążenia siatkówki za pomocą retinografii za pomocą urządzenia Topcon TRC-NW6S (Electronics®, Tokio, Japonia).

Ocena markerów stresu oksydacyjnego i aktywności układu przeciwutleniającego

Aby ocenić stan redoks, poziom utleniania lipidów (peroksydacji lipidów) i białek w osoczu i moczu zostanie określony poprzez oznaczenie ilościowe substancji reaktywnych wobec kwasu tiobarbiturowego (TBARS) i zredukowanych tioli, zgodnie z przytoczonymi protokołami [22,23]. Obie metody umożliwiają ocenę ilościową metodami spektrofotometrycznymi. Analizy zostaną przeprowadzone przy użyciu analizatora Asys UVM-340 (Biochrom®, Cambridge, UK). Funkcja enzymatyczna peroksydazy glutationowej, katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej będzie mierzona jako aktywność enzymatyczna za pomocą analizatora Asys UVM-340 (Biochrom®, Cambridge, UK) zgodnie z przywołanymi protokołami [24,25]. Cechy struktury enzymów przeciwutleniających w oparciu o wzorce glikacji i glikooksydacji zostaną ocenione za pomocą proteomiki, w tym SDS-PAGE, chromatografii i spektrometrii mas [26-28].

Oznaczanie stanu glikacji i glikooksydacji

Procent hemoglobiny glikowanej będzie oceniany za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z analizatorem Hemoglobina next (A. Menarini Diagnostics®, Florencja, Włochy). Poziomy fruktozaminy będą oznaczane metodą enzymatyczną diazymowych białek surowicy (Diazyme, Kent, UK) na analizatorze Advia 2400 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.®, Tarrytown, USA). Procent albuminy glikowanej będzie szacowany na podstawie poziomów fruktozaminy i albuminy [29,30]. Ocena laboratorium zostanie przeprowadzona przez oddział Centralnego Laboratorium Szpitalnego.

Ogólne poziomy glikooksydacji zostaną określone ilościowo poprzez oznaczenie końcowych produktów zaawansowanej glikacji (AGE) w skórze za pomocą czytnika AGE (DiagnOptics BV®, Groningen, Holandia). AGE reprezentują głównie glikowane addukty związane z białkami powstające podczas procesów glikooksydacji. Czytnik AGE został opracowany w celu nieinwazyjnej oceny autofluorescencji skóry (SAF) z wykorzystaniem właściwości fluorescencyjnych różnych AGE [31].

Wyniki w ryzyku sercowo-naczyniowym

Zmierzymy liczbę konsultacji potrzebnych do leczenia (NNT) oraz czas eksploracji w celu wykrycia nieprawidłowości w biomechanice tętnic i uszkodzeń narządów docelowych (TOD), a tym samym określimy zwiększoną CVR uzasadniającą intensyfikację terapii. Oceniane będą również zdarzenia sercowo-naczyniowe i mózgowo-naczyniowe, przyjęcia do szpitala, konsultacje, śmierć i niepełnosprawność [32].

Względy etyczne i dobra praktyka kliniczna

Badanie to zostanie przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi Deklaracji Helsińskiej oraz standardami dobrej praktyki badawczej Galicyjskiej (Hiszpania) Służby Zdrowia (SERGAS). Od wszystkich pacjentów, którzy wyrazili zgodę na udział w badaniu, uzyskana zostanie pisemna świadoma zgoda. Protokoły zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Badań Naukowych w Santiago-Lugo (kody 2021/401 i 2023/302).

Plan pracy i przebieg projektu

W pierwszym etapie planujemy uwzględnić w badaniu pacjentów spełniających kryteria i wyrażających zgodę na udział w badaniu. Ocena kliniczno-antropometryczna, biomechanika tętnic, wykrywanie TOD i pobieranie próbek zostaną przeprowadzone w ramach jednej czynności medycznej. Markery biomechaniczne, stres oksydacyjny, glikacja i glikooksydacja zostaną określone ilościowo zarówno u pacjentów z zaburzeniami biomechanicznymi, jak i bez nich oraz u pacjentów z TOD tętniczym. Celem tej fazy jest ocena różnic pomiędzy grupami pacjentów na podstawie parametrów biomechanicznych i tętniczego TOD. W podgrupie pacjentów zostaną również ocenione różnice w strukturze i funkcji enzymów antyoksydacyjnych pod względem poziomów glikacji i glikooksydacji oraz ich związek z nieprawidłowościami biomechanicznymi tętnic i TOD. Faza ta obejmie wyodrębnienie, gromadzenie, przetwarzanie i analizę danych wstępnych, a także osiągnięcie wstępnych wyników projektu.

W drugiej fazie

1. Pacjenci bez nieprawidłowości biomechanicznych lub TOD zostaną poddani 5-letniej obserwacji z roczną i końcową oceną nieprawidłowości biomechanicznych, TOD i wyników sercowo-naczyniowych. Celem tej fazy jest ocena różnic we wcześniejszych markerach pomiędzy grupami pacjentów na podstawie parametrów biomechanicznych i tętniczego TOD. W podgrupie pacjentów zostaną również ocenione różnice w strukturze i funkcji enzymów antyoksydacyjnych pod względem poziomu glikacji i glikooksydacji oraz ich związek z nieprawidłowościami biomechanicznymi tętnic i TOD. Faza ta obejmie ekstrakcję, gromadzenie, przetwarzanie i analizę danych wstępnych, a także osiągnięcie ostatecznych rezultatów projektu.
2. Pacjenci z nieprawidłowościami biomechanicznymi i/lub TOD zostaną poddani 5-letniej obserwacji z roczną i końcową oceną progresji TOD i wyników sercowo-naczyniowych. Celem tej fazy jest ocena różnic we wcześniejszych markerach pomiędzy grupami pacjentów na podstawie tętniczego TOD i wyników sercowo-naczyniowych. W podgrupie pacjentów zostaną ocenione różnice w strukturze i funkcji enzymów antyoksydacyjnych pod względem poziomów glikacji i glikooksydacji oraz ich związek z TOD i wynikami sercowo-naczyniowymi. Faza ta obejmie ekstrakcję, gromadzenie, przetwarzanie i analizę danych wstępnych, a także osiągnięcie ostatecznych rezultatów projektu.

Analiza matematyczna i modelowanie

Wykorzystany zostanie pakiet oprogramowania statystycznego SPSS 22.0 (SPSS Inc.®, Chicago, IL, EE.UU). Przeprowadzone zostanie podejście statystyki opisowej, obejmujące ocenę normalności zmiennych ilościowych. Statystyki jednoczynnikowe zostaną wykorzystane do porównania grup z określonymi testami w zależności od typu zmiennej. Jeżeli zostaną znalezione odpowiednie wyniki, zostaną przeprowadzone badania korelacji liniowej. Po analizie jednowymiarowej zostaną skonstruowane modele wieloczynnikowe, zarówno wyjaśniające powiązanie czynników predykcyjnych z wynikami, jak i predykcyjne dla ryzyka nieprawidłowości biomechanicznych, TOD i wyników sercowo-naczyniowych. Aby ocenić czynniki, które mogą mieć wpływ na parametry biomechaniczne, TOD i wyniki sercowo-naczyniowe w czasie, zastosowane zostaną specjalne procedury matematyczne związane z podejściem do modelowania stawów i analizą szeregów czasowych. Obliczenia wielkości próby będą opierać się na konkretnych testach statystycznych zgodnie z typem zmiennej i rozkładem, zawsze biorąc pod uwagę umiarkowaną wielkość efektu, 95% przedział ufności (95% CI) i co najmniej 80% moc [33-35].

BIBLIOGRAFIA

1. Wang MC, Lloyd-Jones DM. Ocena ryzyka sercowo-naczyniowego u pacjentów z nadciśnieniem. Am J Hypertens 2021;34:569-77. https://doi.org/10.1093/ajh/hpab021.
2. Piskorz D. Nadciśnieniowe uszkodzenie narządów i leczenie nadciśnienia. Jak ocenić korzystne efekty leczenia hipotensyjnego? High Blood Press Cardiovasc Poprzedni 2020;27:9-17. https://doi.org/10.1007/s40292-020-00361-6.
3. Simon BR, Kaufmann MV, McAfee MA, Baldwin AL. Modele elementów skończonych w mechanice ścian tętnic. J Biomech Eng 1993;115:489-96. https://doi.org/10.1115/1.2895529.
4. Guzik TJ, Touyz RM. Stres oksydacyjny, zapalenie i starzenie się naczyń w nadciśnieniu. Nadciśnienie 2017;70:660-7. https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.117.07802.
5. Vistoli G, De Maddis D, Cipak A, Zarkovic N, Carini M, Aldini G. Zaawansowane produkty końcowe glikooksydacji i lipoksydacji (AGE i ALE): przegląd mechanizmów ich powstawania. Free Radic Res 2013;47 Dodatek 1:3-27. https://doi.org/10.3109/10715762.2013.815348.
6. Gianazza E, Brioschi M, Fernandez AM, Banfi C. Lipoksydacja w chorobach sercowo-naczyniowych. Redox Biol 2019;23:101119. https://doi.org/10.1016/j.redox.2019.101119.
7. Al-Kuraishy HM, Sami OM, Hussain NR, Al-Gareeb AI. Metformina i/lub wildagliptyna łagodzą stres oksydacyjny wywołany cukrzycą typu II: intrygujący efekt. J Adv Pharm Technol Res 2020;11:142-7. https://doi.org/10.4103/japtr.JAPTR_18_20.
8. poseł Mattson. Rola produktu peroksydacji lipidów 4-hydroksynonenalu w otyłości, zespole metabolicznym i powiązanych zaburzeniach naczyniowych i neurodegeneracyjnych. Exp Gerontol 2009;44:625-33. https://doi.org/10.1016/j.exger.2009.07.003.
9. Szpital Clínico Universitario de Santiago - Área Sanitaria de Santiago de Compostela y Barbanza (Hospitales, Centros de Salud, Casas del Mar y Consultorios) n.d. https://xxisantiago.sergas.es/Paxinas/web.aspx?tipo=paxtab&idLista=3&idContido=183&migtab=174%3B183&idioma=es (dostęp: 12 marca 2024 r.).
10. Visseren FLJ, Mach F, Smulders YM, Carballo D, Koskinas KC, Bäck M i in. Wytyczne ESC 2021 dotyczące profilaktyki chorób układu krążenia w praktyce klinicznej. Eur Heart J 2021;42:3227-337. https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehab484.
11. Briasoulis A, Agarwal V, Messerli FH. Spożycie alkoholu i ryzyko nadciśnienia u mężczyzn i kobiet: przegląd systematyczny i metaanaliza. J Clin Hypertens (Greenwich) 2012;14:792-8. https://doi.org/10.1111/jch.12008.
12. Amos A, Greaves L, Nichter M, Bloch M. Kobiety i tytoń: wezwanie do uwzględnienia płci w badaniach, polityce i praktyce w zakresie kontroli tytoniu. Kontrola tytoniu 2012;21:236-43. https://doi.org/10.1136/tobaccocontrol-2011-050280.
13. ElSayed NA, Aleppo G, Aroda VR, Bannuru RR, Brown FM, Bruemmer D i in. 2. Klasyfikacja i diagnostyka cukrzycy: Standardy postępowania w cukrzycy – 2023. Opieka nad cukrzycą 2023;46:S19-40. https://doi.org/10.2337/dc23-S002.
14. Autorzy/członkowie grupy zadaniowej: McDonagh TA, Metra M, Adamo M, Gardner RS, Baumbach A i in. Wytyczne ESC 2021 dotyczące diagnostyki i leczenia ostrej i przewlekłej niewydolności serca: opracowane przez Grupę Zadaniową ds. diagnostyki i leczenia ostrej i przewlekłej niewydolności serca Europejskiego Towarzystwa Kardiologicznego (ESC). Ze szczególnym udziałem Stowarzyszenia Niewydolności Serca (HFA) należącego do ESC. Eur J. Awaria serca 2022;24:4-131. https://doi.org/10.1002/ejhf.2333.
15. Bozkurt Yılmaz HE, Yılmaz M. Ocena rozciągliwości i elastyczności tętnicy szyjnej u pacjentów chorych na astmę. Iran J. Alergia na astmę Immunol 2021;20:279-86. https://doi.org/10.18502/ijaai.v20i3.6329.
16. Kane JW, Sternheim MM. Fizyka. Przywróć; 1989.
17. Molinari F, Zeng G, Suri JS. Przegląd najnowocześniejszego pomiaru grubości błony wewnętrznej i środkowej (IMT) i technik segmentacji ścian w ultrasonografii tętnic szyjnych. Programy metod obliczeniowych Biomed 2010;100:201-21. https://doi.org/10.1016/j.cmpb.2010.04.007.
18. Andrikou I, Tsioufis C, Konstantinidis D, Kasiakogias A, Dimitriadis K, Leontsinis I i in. Wskaźnik oporu nerkowego u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym. J Clin Hypertens (Greenwich) 2018;20:1739-44. https://doi.org/10.1111/jch.13410.
19. Elastografia ultradźwiękowa: przegląd technik i zastosowań klinicznych - PubMed n.d. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28435467/ (dostęp: 12 marca 2024 r.).
20. Ji H, Xiong J, Yu S, Chi C, Bai B, Telewubai J i in. Pomiar prędkości fali tętna tętnicy szyjnej i kości udowej (Cf-PWV) w celu oceny sztywności tętnicy. J Vis Exp 2018:57083. https://doi.org/10.3791/57083.
21. Zwakenberg SR, de Jong PA, Hendriks EJ, Westerink J, Spiering W, de Borst GJ i in. Zwapnienie błony wewnętrznej i środkowej a czynniki ryzyka sercowo-naczyniowego. PLoS One 2020;15:e0235228. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235228.
22. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Oznaczenie nadtlenków lipidów w tkankach zwierzęcych metodą reakcji kwasu tiobarbiturowego. Anal Biochem 1979;95:351-8. https://doi.org/10.1016/0003-2697(79)90738-3.
23. Ellman GL. Tkankowe grupy sulfhydrylowe. Arch Biochem Biophys 1959; 82: 70-7. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6.
24. Aebi H. Katalaza in vitro. Metody Enzymol 1984;105:121-6. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(84)05016-3.
25. Flohé L, Günzler WA. Oznaczenia peroksydazy glutationowej. Metody Enzymol 1984;105:114-21. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(84)05015-1.
26. Kwas M, Bucholc B, Slusarczyk J. Zastosowanie elektroforezy w żelu poliakrylomidowym (SDS_PAGE) do oceny struktury IgG – głównego składnika ludzkiej immunoglobuliny podawanej dożylnie. Med Dosw Mikrobiol 2000;52:301-9.
27. Chaila MZ, Viniegra M, Gagliardino JJ, Martínez A, Simesen de Bielke MG, Frusti M i in. Pomiar hemoglobiny glikowanej: porównanie trzech metod z wysokosprawną chromatografią cieczową. J Diabetes Sci Technol 2022;16:724-31. https://doi.org/10.1177/1932296821997179.
28. van Schaick G, Pot S, Schouten O, den Hartog J, Akeroyd M, van der Hoeven R i in. Ocena wpływu glikacji na aktywność lipazy za pomocą chromatografii powinowactwa boronianowego i spektrometrii mas. Chemia spożywcza 2023;421:136147. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.136147.
29. Hoelzel W, Weykamp C, Jeppsson J-O, Miedema K, Barr JR, Goodall I i in. System referencyjny IFCC do pomiaru hemoglobiny A1c we krwi ludzkiej i krajowe schematy normalizacji w Stanach Zjednoczonych, Japonii i Szwecji: badanie porównawcze metod. Clin Chem 2004;50:166-74. https://doi.org/10.1373/clinchem.2003.024802.
30. Wu W-C, Ma W-Y, Wei J-N, Yu T-Y, Lin M-S, Shih S-R i in. Albumina glikowana w surowicy jako pomoc w diagnostyce cukrzycy. PLoS One 2016;11:e0146780. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146780.
31. Atzeni IM, van de Zande SC, Westra J, Zwerver J, Smit AJ, Mulder DJ. Czytnik AGE: nieinwazyjna metoda oceny długoterminowego uszkodzenia tkanek. Metody 2022;203:533-41. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.02.016.
32. Wolff G, Lin Y, Akbulut C, Brockmeyer M, Parco C, Hoss A i in. Metaanaliza liczb potrzebnych do leczenia nowych leków przeciwcukrzycowych ze względu na skutki sercowo-naczyniowe. ESC Niewydolność serca 2023;10:552-67. https://doi.org/10.1002/ehf2.14213.
33. Diaz-Louzao C, Barrera-Lopez L, Lopez-Rodriguez M, Casar C, Vazquez-Agra N, Pernas-Pardavila H i in. Podłużny związek uszkodzenia wątroby z biomarkerami stanu zapalnego u pacjentów hospitalizowanych z powodu Covid-19 przy użyciu wspólnego podejścia do modelowania. Rep. Nauki 2022;12:5547. https://doi.org/10.1038/s41598-022-09290-x.
34. Malone HE, Nicholl H, Coyne I. Podstawy szacowania wielkości próby. Pielęgniarka Res 2016;23:21-5. https://doi.org/10.7748/nr.23.5.21.s5.
35. Cohen J. Statystyczna analiza mocy dla nauk behawioralnych. wydanie 2. Nowy Jork: Routledge; 1988. https://doi.org/10.4324/9780203771587.