Glykoksidaatio, valtimoiden biomekaniikka ja kohde-elinten vauriot (GlycOxiTOD)

JOHDANTO

Ateroskleroottinen sydän- ja verisuonisairaus (ASCVD) on yksi johtavista sairastuvuuden ja kuolleisuuden syistä väestössä. Verenpainetauti (AHT) muiden sydän- ja verisuoniriskitekijöiden (CVR) ohella altistaa poikkeavuuksille suurten ja pienten valtimoiden rakenteessa ja toiminnassa, mikä johtaa ennenaikaiseen verisuonten ikääntymiseen ja huipentuu kohdeelinvaurion (TOD) kehittymiseen. selkeä, mutta alidiagnosoitu ASCVD:n esiaste. Kaikille potilaille ei kuitenkaan kehity TOD:ta, eivätkä he tapahdu samalla ajanjaksolla tai samalla intensiteetillä. Lisäksi potilailla, joilla on alun perin alhainen tai kohtalainen CVR, katsotaan jo olevan kohtalainen tai korkea CVR, kun esiintyy TOD:ta tiukemmat terapeuttiset tavoitteet [1,2].

Verisuonten biomekaniikka keskittyy ensisijaisesti valtimoiden mekaanisten ominaisuuksien ja käyttäytymisen tutkimukseen. Epäsuotuisa valtimoiden biomekaniikka liittyy ateroskleroosin ja arterioskleroosin kehittymiseen ja etenemiseen. Nämä prosessit edustavat jatkumoa verisuonivaurioita, joita välittää hapettuneiden lipoproteiinien kerääntyminen subendoteliaaliseen tilaan, tulehdusreittien aktivoituminen ja vahvistuminen sekä valtimofibroosin ja kalkkeutumisen kehittyminen. Näiden ilmiöiden ytimessä on endoteelin toimintahäiriö, jolle on tunnusomaista lisääntynyt läpäisevyys ja verisuonten endoteelin suodatuskyvyn menetys haitallisille molekyyleille valtimon seinämään [3,4].

Oksidatiivisella stressillä, joka määritellään epätasapainoksi reaktiivisten lajien tuotannon ja antioksidanttijärjestelmien välillä edellisen hyväksi, on ratkaiseva rooli endoteelin toimintahäiriöiden, hapettuneiden lipoproteiinien laskeutumisen ja tulehdusta edistävän vuorovaikutuksen kehittymisessä näiden ja mononukleaari-fagosyyttijärjestelmän välillä. Reaktiivisten happilajien (ROS) ja muiden kerääntyminen indusoi lipidien peroksidaatio- ja glykoksidaatioilmiöitä, jotka huipentuvat edistyneiden lipoksidaatio- ja glykaation lopputuotteiden (ALE:t ja AGE:t, vastaavasti) muodostumiseen. ALE:t ja AGE:t voivat sitoutua proteiineihin aiheuttaen toiminnallisia ja rakenteellisia poikkeavuuksia ja vaikuttaa myös solujen signalointiin aktivoimalla muun muassa kuolemanreittejä [5,6].

Epäsuotuisa redox-tila ja glykaatiotasot liittyvät ikääntymiseen, rappeuttaviin sairauksiin ja kertyneisiin verisuonivaurioihin tietyissä alapopulaatioissa, erityisesti potilailla, joilla on diabetes mellitus (DM). Kuitenkin vain vähän tiedetään antioksidanttijärjestelmän glykaation ja glyoksidaation vaikutuksesta valtimoiden biomekaniikkaan ja kohde-elinvaurioiden kehittymiseen näennäisesti terveillä potilailla, joilla on kohtalainen tai korkea CVR. Pyrimme tutkimaan valtimoiden biomekaanisten poikkeavuuksien ja TOD:n välistä erityissuhdetta seerumin glykaatiotasojen, glykoksidaatiotilan ja joidenkin antioksidanttijärjestelmän elementtien toiminta-rakenteen tasapainon kanssa korostaen katalaasia, superoksididismutaasia ja glutationiperoksidaasia [4,7,8].

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Projektin suunnittelu ja asennus

Tämä on havainnollinen, ambispektiivinen ja monikeskusprojekti, jota edistää Santiago de Compostelan yliopistollisen sairaalan sisätautien osaston hypertension ja sydän- ja verisuoniriskien yksikkö. Ehdokkaat potilaat ovat henkilöitä, jotka kuuluvat Santiago de Compostelan ja Barbanzan integroidun johtamisen organisatoriseen rakenteeseen (EOXI), jotka hakevat konsultaatiota sydän- ja verisuoniriskin diagnosointiin, hallintaan ja seurantaan [9].

Osallistujat. Sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerit

Konsultoitujen potilaiden kokonaisjoukosta valitaan esivalinnassa vain yli 18-vuotiaat henkilöt, joilla on kohtalainen tai korkea kardiovaskulaarinen riskiprofiili ohjearvojen perusteella. Poissulkemiskriteereitä ovat DM:n esiintyminen nykyisten kliinisen käytännön ohjeiden mukaisesti, tupakointitottumus (määritelty nykyiseksi kulutukseksi ja työhönottoa edeltäneiden 6 kuukauden aikana), riskialtis alkoholinkäyttö (määritelty yli 10 g:n ja 20 g:n päivittäiseksi kulutukseksi naisilla ja miehillä vastaavasti) ja todettu sydän- ja verisuonisairaus [10-14].

Valtimoiden biomekaanisten merkkiaineiden ja TOD:n arviointi

Suoritamme kahdenvälisen ultraäänitutkimuksen yhteisestä kaulavaltimosta (CCA), sisäisestä kaulavaltimosta (ICA) ja alaraajojen distaalisista valtimoista Mindray Z60 -laitteella (Mindray®, Guangdong, Kiina) korkeataajuisella anturilla. Seuraavat mittaukset ja laskelmat poimitaan:

1. Liiketilassa (M-moodi) samanaikainen valtimon säteen, valtimopaineen ja seinämän kokonaispaksuuden mittaus venytys- ja jännitysparametrien laskemiseksi CCA:n keskisegmentissä [15,16].
2. Kaksiulotteisessa tilassa (B-moodi) automaattinen intima-median paksuuden (IMT) mittaus CCA:n distaalisella alueella sekä kolesteroliplakin havaitseminen ja karakterisointi[17].
3. Spektrisessä Doppler-moodissa tilavuus-aika (virtaus) -funktion morfologinen kuvaus virtausnopeuksilla ja verisuonten vastusindeksillä CCA:n ja ICA:n keskisegmentissä [18].
4. B-tilassa elastografiamoduulilla paikallisen jäykkyysasteen suora arviointi CCA:n keskisegmentissä [19].
5. Spektrisessä Doppler-moodissa EKG-synkronoinnin kanssa kaulavaltimon ja reisiluun pulssiaallon nopeuden (c-f PWV) arviointi [20].
6. Spektrisessä Doppler-moodissa nilkka-olkivartalon indeksin (ABI) arviointi [21].

Arvioimme myös verkkokalvon mikroverisuonten alkavat vauriot retinografialla Topcon TRC-NW6S -laitteella (Electronics®, Tokio, Japani).

Oksidatiivisen stressin merkkiaineiden ja antioksidanttijärjestelmän aktiivisuuden ja rakenteen arviointi

Redox-tilan arvioimiseksi lipidien hapettumisen (lipidiperoksidaatio) ja proteiinien tasot plasmassa ja virtsassa määritetään kvantifioimalla tiobarbituurihapporeaktiiviset aineet (TBARS) ja pelkistyneet tiolit, vastaavasti, viitattujen protokollien mukaisesti [22,23]. Molemmat menetelmät mahdollistavat kvantifioinnin spektrofotometrisilla menetelmillä. Analyysit suoritetaan käyttämällä Asys UVM-340 -analysaattoria (Biochrom®, Cambridge, UK). Glutationiperoksidaasin, katalaasin ja superoksididismutaasin entsymaattinen toiminta mitataan entsymaattisena aktiivisuutena Asys UVM-340 -analysaattorilla (Biochrom®, Cambridge, UK) viitattujen protokollien mukaisesti [24,25]. Antioksidanttientsyymien rakenneominaisuudet, jotka perustuvat glykaatio- ja glyoksidaatiomalleihin, arvioidaan käyttämällä proteomiikkaa, mukaan lukien SDS-PAGE, kromatografia ja massaspektrometria [26-28].

Glykaatio- ja glykoksidaatiotilan määritys

Glykoituneen hemoglobiinin prosenttiosuus määritetään käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) Hemoglobin next -analysaattorilla (A. Menarini Diagnostics®, Firenze, Italia). Fruktosamiinitasot määritetään diatsyymin glykoituneen seerumiproteiinin entsymaattisella menetelmällä (Diazyme, Kent, UK) Advia 2400 -analysaattorilla (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.®, Tarrytown, USA). Glykoituneen albumiinin prosenttiosuus arvioidaan fruktosamiini- ja albumiinitasojen perusteella [29,30]. Tämän laboratorioarvioinnin suorittaa Keskussairaalan laboratorioosasto.

Yleiset glykoksidaatiotasot kvantifioidaan määrittämällä kehittyneet glykaation lopputuotteet (AGE) ihossa käyttämällä AGE Reader -laitetta (DiagnOptics BV®, Groningen, Alankomaat). AGE:t edustavat pääasiassa proteiineihin sitoutuneita glykoituneita additiotuotteita, jotka syntyvät glyoksidaatioprosessien aikana. AGE Reader on kehitetty arvioimaan ihon autofluoresenssia (SAF) ei-invasiivisesti käyttämällä eri AGE:iden fluoresoivia ominaisuuksia [31].

Tulokset sydän- ja verisuoniriskissä

Mittaamme hoitoon tarvittavien konsultaatioiden määrän (NNT) ja tutkimusajan havaitaksemme poikkeavuuksia valtimoiden biomekaniikassa ja kohde-elinten vaurioissa (TOD) ja määritämme siten lisääntyneen CVR:n, joka oikeuttaa terapeuttisen tehostamisen. Myös sydän- ja aivoverisuonitapahtumat, sairaalahoidot, konsultaatiot, kuolemat ja vammaisuus arvioidaan [32].

Eettiset näkökohdat ja hyvä kliininen käytäntö

Tämä tutkimus tehdään Helsingin julistuksen eettisten periaatteiden ja Galician (Espanja) Terveyspalvelun (SERGAS) tutkimuksen hyvien käytäntöjen standardien mukaisesti. Kirjallinen tietoinen suostumus hankitaan kaikilta potilailta, jotka suostuivat osallistumaan. Protokollat ​​hyväksyi Santiago-Lugon tutkimuseettinen komitea (koodit 2021/401 ja 2023/302).

Työsuunnitelma ja projektikulku

Ensimmäisessä vaiheessa aiomme ottaa mukaan kriteerit täyttäviä ja osallistumiseen suostuvia potilaita. Kliinis-antropometrinen arviointi, valtimoiden biomekaniikka, TOD-detektio ja näytteenotto suoritetaan yhdessä lääketieteellisessä toimenpiteessä. Biomekaaniset, oksidatiiviset stressit, glykaatio- ja glykoksidaatiomarkkerit kvantifioidaan sekä potilailla, joilla on biomekaanisia poikkeavuuksia ja valtimoiden TOD-häiriöitä ja joilla ei ole niitä. Tämän vaiheen tavoitteena on arvioida potilasryhmien välisiä eroja biomekaanisten parametrien ja valtimoiden TOD:n perusteella. Potilaiden alaryhmässä arvioidaan myös eroja antioksidanttientsyymien rakenteessa-toiminnassa glykaatio- ja glykoksidaatiotasojen suhteen sekä niiden suhde valtimoiden biomekaanisiin poikkeaviin ja TOD:iin. Tämä vaihe sisältää alustavien tietojen keräämisen, keräämisen, käsittelyn ja analysoinnin sekä hankkeen alkutulosten saavuttamisen.

Toisessa vaiheessa,

1. Potilaita, joilla ei ole biomekaanisia poikkeavuuksia tai TOD:ta, seurataan 5 vuoden ajan, ja biomekaanisten poikkeavuuksien, TOD:n ja kardiovaskulaaristen tulosten vuosittaiset ja lopulliset arviot tehdään. Tämän vaiheen tavoitteena on arvioida eroja aikaisemmissa markkereissa potilasryhmien välillä biomekaanisten parametrien ja valtimoiden TOD:n perusteella. Potilaiden alaryhmässä arvioidaan myös eroja antioksidanttientsyymien rakenteessa-toiminnassa glykaatio- ja glykoksidaatiotasojen suhteen sekä niiden suhde valtimoiden biomekaanisiin poikkeaviin ja TOD:iin. Tämä vaihe sisältää alustavien tietojen keräämisen, keräämisen, käsittelyn ja analysoinnin sekä hankkeen lopullisten tulosten saavuttamisen.
2. Potilaita, joilla on biomekaanisia poikkeavuuksia ja/tai TOD:ta, seurataan 5 vuoden ajan, ja TOD:n etenemisestä ja kardiovaskulaarisista tuloksista arvioidaan vuosittain ja lopullinen. Tämän vaiheen tavoitteena on arvioida eroja aikaisemmissa markkereissa potilasryhmien välillä perustuen valtimoiden TOD:iin ja kardiovaskulaarisiin tuloksiin. Potilaiden alaryhmässä arvioidaan eroja antioksidanttientsyymien rakenteessa ja toiminnassa glykaatio- ja glykoksidaatiotasojen suhteen sekä niiden suhde TOD:iin ja kardiovaskulaarisiin tuloksiin. Tämä vaihe sisältää alustavien tietojen keräämisen, keräämisen, käsittelyn ja analysoinnin sekä hankkeen lopullisten tulosten saavuttamisen.

Matemaattinen analyysi ja mallintaminen

Käytössä on SPSS 22.0 -tilastoohjelmistopaketti (SPSS Inc.®, Chicago, IL, EE.UU). Suoritetaan kuvaava tilastollinen lähestymistapa, mukaan lukien kvantitatiivisten muuttujien normaaliuden arviointi. Yksimuuttujatilastoja käytetään ryhmien vertaamiseen tietyillä testeillä muuttujan tyypistä riippuen. Jos asiaankuuluvia tuloksia löytyy, suoritetaan lineaariset korrelaatiotutkimukset. Yksimuuttuja-analyysin jälkeen rakennetaan monimuuttujamalleja, jotka sekä selittävät ennustajien yhdistämistä tuloksiin että ennustavat biomekaanisten poikkeavuuksien riskiä, ​​TOD:ta ja kardiovaskulaarisia tuloksia. Biomekaanisiin parametreihin, TOD:iin ja kardiovaskulaarisiin tuloksiin ajan mittaan vaikuttavien tekijöiden arvioimiseksi käytetään erityisiä matemaattisia menetelmiä, jotka liittyvät yhteisen mallinnuksen lähestymistapaan ja aikasarjaanalyysiin. Otoskokolaskelmat perustuvat erityisiin tilastollisiin testeihin muuttujan tyypin ja jakauman mukaan ottaen aina huomioon kohtalaisen vaikutuksen koon, 95 %:n luottamusvälin (95 %CI) ja vähintään 80 %:n tehon [33-35].

VIITTEET

1. Wang MC, Lloyd-Jones DM. Sydän- ja verisuoniriskin arviointi hypertensiivisillä potilailla. Am J Hypertens 2021;34:569-77. https://doi.org/10.1093/ajh/hpab021.
2. Piskorz D. Hypertensive Mediated Organ Damage and Hypertension Management. Kuinka arvioida verenpainetta alentavien hoitojen hyödyllisiä vaikutuksia? Korkea verenpaine Cardiovasc Ed. 2020;27:9-17. https://doi.org/10.1007/s40292-020-00361-6.
3. Simon BR, Kaufmann MV, McAfee MA, Baldwin AL. Elementtimallit valtimon seinämien mekaniikkaan. J Biomech Eng 1993;115:489-96. https://doi.org/10.1115/1.2895529.
4. Guzik TJ, Touyz RM. Oksidatiivinen stressi, tulehdus ja verisuonten ikääntyminen hypertensiossa. Hypertensio 2017;70:660-7. https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.117.07802.
5. Vistoli G, De Maddis D, Cipak A, Zarkovic N, Carini M, Aldini G. Advanced glycoxidation and lipoxidation end products (AGEs and ALEs): yleiskatsaus niiden muodostumismekanismeihin. Free Radic Res 2013;47 Suppl 1:3-27. https://doi.org/10.3109/10715762.2013.815348.
6. Gianazza E, Brioschi M, Fernandez AM, Banfi C. Lipoksidaatio sydän- ja verisuonisairauksissa. Redox Biol 2019;23:101119. https://doi.org/10.1016/j.redox.2019.101119.
7. Al-Kuraishy HM, Sami OM, Hussain NR, Al-Gareeb AI. Metformiini ja/tai vildagliptiini lieventävät tyypin II diabetes mellituksen aiheuttamaa oksidatiivista stressiä: kiehtova vaikutus. J Adv Pharm Technol Res 2020;11:142-7. https://doi.org/10.4103/japtr.JAPTR_18_20.
8. Mattson kansanedustaja. Lipidiperoksidaatiotuotteen 4-hydroksinonenaalin roolit liikalihavuudessa, metabolisessa oireyhtymässä ja niihin liittyvissä verisuoni- ja neurodegeneratiivisissa sairauksissa. Exp Gerontol 2009;44:625-33. https://doi.org/10.1016/j.exger.2009.07.003.
9. Hospital Clínico Universitario de Santiago - Área Sanitaria de Santiago de Compostela y Barbanza (sairaalat, Centros de Salud, Casas del Mar y Consultorios) n.d. https://xxisantiago.sergas.es/Paxinas/web.aspx?tipo=paxtab&idLista=3&idContido=183&migtab=174%3B183&idioma=es (käytetty 12. maaliskuuta 2024).
10. Visseren FLJ, Mach F, Smulders YM, Carballo D, Koskinas KC, Bäck M, et ai. 2021 ESC:n ohjeet sydän- ja verisuonitautien ehkäisyyn kliinisessä käytännössä. Eur Heart J 2021;42:3227-337. https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehab484.
11. Briasoulis A, Agarwal V, Messerli FH. Alkoholin kulutus ja verenpainetaudin riski miehillä ja naisilla: systemaattinen katsaus ja meta-analyysi. J Clin Hypertens (Greenwich) 2012;14:792-8. https://doi.org/10.1111/jch.12008.
12. Amos A, Greaves L, Nichter M, Bloch M. Naiset ja tupakka: kehotus sisällyttää sukupuoli tupakantorjuntatutkimukseen, -politiikkaan ja -käytäntöihin. Tobacco Control 2012;21:236-43. https://doi.org/10.1136/tobaccocontrol-2011-050280.
13. ElSayed NA, Aleppo G, Aroda VR, Bannuru RR, Brown FM, Bruemmer D, et ai. 2. Diabeteksen luokittelu ja diagnoosi: Diabeteksen hoitostandardit-2023. Diabetes Care 2023;46:S19-40. https://doi.org/10.2337/dc23-S002.
14. Tekijät/työryhmän jäsenet: McDonagh TA, Metra M, Adamo M, Gardner RS, Baumbach A, et al. 2021 ESC:n ohjeet akuutin ja kroonisen sydämen vajaatoiminnan diagnosointiin ja hoitoon: Euroopan kardiologiyhdistyksen (ESC) akuutin ja kroonisen sydämen vajaatoiminnan diagnosointia ja hoitoa käsittelevän työryhmän on kehittänyt. ESC:n Heart Failure Associationin (HFA) erityispanoksella. Eur J Heart Fail 2022;24:4-131. https://doi.org/10.1002/ejhf.2333.
15. Bozkurt Yılmaz HE, Yılmaz M. Astmapotilaiden kaulavaltimon venymättömyyden ja elastisuuden arviointi. Iran J Allergy Asthma Immunol 2021;20:279-86. https://doi.org/10.18502/ijaai.v20i3.6329.
16. Kane JW, Sternheim MM. Física. Reverte; 1989.
17. Molinari F, Zeng G, Suri JS. Huippuluokan katsaus intima-media paksuuden (IMT) mittaukseen ja seinämän segmentointitekniikoihin kaulavaltimon ultraäänitutkimuksessa. Comput Methods Programs Biomed 2010;100:201-21. https://doi.org/10.1016/j.cmpb.2010.04.007.
18. Andrikou I, Tsioufis C, Konstantinidis D, Kasiakogias A, Dimitriadis K, Leontsinis I, et ai. Munuaisten resistiivinen indeksi hypertensiivisillä potilailla. J Clin Hypertens (Greenwich) 2018; 20:1739-44. https://doi.org/10.1111/jch.13410.
19. Ultraäänielastografia: tekniikoiden ja kliinisten sovellusten katsaus - PubMed n.d. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28435467/ (käytetty 12. maaliskuuta 2024).
20. Ji H, Xiong J, Yu S, Chi C, Bai B, Teliewubai J et ai. Kaulavaltimon ja reisiluun pulssiaallon nopeuden mittaaminen (Cf-PWV) valtimon jäykkyyden arvioimiseksi. J Vis Exp 2018:57083. https://doi.org/10.3791/57083.
21. Zwakenberg SR, de Jong PA, Hendriks EJ, Westerink J, Spiering W, de Borst GJ, et ai. Intimaalinen ja mediaalinen kalkkeutuminen suhteessa kardiovaskulaarisiin riskitekijöihin. PLoS One 2020;15:e0235228. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235228.
22. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Testi lipidiperoksideille eläinkudoksissa tiobarbituurihapporeaktiolla. Anal Biochem 1979;95:351-8. https://doi.org/10.1016/0003-2697(79)90738-3.
23. Ellman GL. Kudosten sulfhydryyliryhmät. Arch Biochem Biophys 1959;82:70-7. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6.
24. Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzymol 1984;105:121-6. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(84)05016-3.
25. Flohé L, Günzler WA. Glutationiperoksidaasin määritykset. Methods Enzymol 1984;105:114-21. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(84)05015-1.
26. Kwas M, Bucholc B, Slusarczyk J. [Elektroforeesin käyttö polyakrylomidigeelissä (SDS_PAGE) IgG-rakenteen arvioimiseksi - ihmisen suonensisäisen immunoglobuliinin pääkomponentti]. Med Dosw Mikrobiol 2000;52:301-9.
27. Chaila MZ, Viniegra M, Gagliardino JJ, Martínez A, Simesen de Bielke MG, Frusti M, et ai. Glykatoidun hemoglobiinin mittaus: kolmen menetelmän vertailu korkean suorituskyvyn nestekromatografiaan. J Diabetes Sci Technol 2022;16:724-31. https://doi.org/10.1177/1932296821997179.
28. van Schaick G, Pot S, Schouten O, den Hartog J, Akeroyd M, van der Hoeven R, et ai. Glykaation vaikutuksen arviointi lipaasiaktiivisuuteen käyttämällä boronaattiaffiniteettikromatografiaa ja massaspektrometriaa. Food Chem 2023; 421:136147. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.136147.
29. Hoelzel W, Weykamp C, Jeppsson J-O, Miedema K, Barr JR, Goodall I, et ai. IFCC:n vertailujärjestelmä hemoglobiini A1c:n mittaamiseksi ihmisverestä ja kansalliset standardointijärjestelmät Yhdysvalloissa, Japanissa ja Ruotsissa: menetelmien vertailututkimus. Clin Chem 2004;50:166-74. https://doi.org/10.1373/clinchem.2003.024802.
30. Wu W-C, Ma W-Y, Wei J-N, Yu T-Y, Lin M-S, Shih S-R, et ai. Seerumin glykoitu albumiini diabeteksen diagnoosin ohjaamiseen. PLoS One 2016;11:e0146780. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146780.
31. Atzeni IM, van de Zande SC, Westra J, Zwerver J, Smit AJ, Mulder DJ. AGE Reader: Ei-invasiivinen menetelmä pitkäaikaisen kudosvaurion arvioimiseksi. Methods 2022; 203:533-41. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.02.016.
32. Wolff G, Lin Y, Akbulut C, Brockmeyer M, Parco C, Hoss A, et ai. Meta-analysoidut luvut, joita tarvitaan uusien diabeteslääkkeiden hoitoon sydän- ja verisuonisairauksien hoitoon. ESC Heart Fail 2023;10:552-67. https://doi.org/10.1002/ehf2.14213.
33. Diaz-Louzao C, Barrera-Lopez L, Lopez-Rodriguez M, Casar C, Vazquez-Agra N, Pernas-Pardavila H, et ai. Maksavaurion pituussuuntainen suhde tulehduksen biomarkkereihin COVID-19-potilailla sairaalahoidossa käyttämällä yhteismallinnusta. Sci Rep 2022;12:5547. https://doi.org/10.1038/s41598-022-09290-x.
34. Malone HE, Nicholl H, Coyne I. Otoskoon arvioinnin perusteet. Nurse Res 2016;23:21-5. https://doi.org/10.7748/nr.23.5.21.s5.
35. Cohen J. Tilastollinen tehoanalyysi käyttäytymistieteille. 2. painos New York: Routledge; 1988. https://doi.org/10.4324/9780203771587.