Glicoxidação, biomecânica arterial e danos a órgãos-alvo (GlycOxiTOD)

INTRODUÇÃO

A doença cardiovascular aterosclerótica (ASCVD) representa uma das principais causas de morbidade e mortalidade na população. A hipertensão arterial (HAH), juntamente com outros fatores de risco cardiovascular (RCV), predispõe a anormalidades na estrutura e função de grandes e pequenas artérias, levando ao envelhecimento vascular prematuro e culminando no desenvolvimento de danos em órgãos-alvo (TOD), o que ressente-se um precursor claro, mas subdiagnosticado, da DCVA. No entanto, nem todos os pacientes desenvolvem TOD, nem o fazem no mesmo período de tempo ou com a mesma intensidade. Além disso, pacientes que inicialmente apresentam RCV baixa a moderada já são considerados com RCV moderada a alta na presença de TOD, com objetivos terapêuticos mais rigorosos [1,2].

A biomecânica vascular concentra-se principalmente no estudo das propriedades mecânicas e do comportamento das artérias. A biomecânica arterial desfavorável está associada ao desenvolvimento e progressão da aterosclerose e da arteriosclerose. Esses processos representam um continuum de dano vascular mediado pelo acúmulo de lipoproteínas oxidadas no espaço subendotelial, ativação e amplificação de vias inflamatórias e desenvolvimento de fibrose arterial e calcificação. No cerne desses fenômenos está a ocorrência de disfunção endotelial, caracterizada pelo aumento da permeabilidade e perda da capacidade de filtragem do endotélio vascular de moléculas deletérias para a parede arterial [3,4].

O estresse oxidativo, definido como um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e os sistemas antioxidantes em favor dos primeiros, desempenha um papel crucial no desenvolvimento da disfunção endotelial, na deposição de lipoproteínas oxidadas e na interação pró-inflamatória entre estas e o sistema fagocitário mononuclear. O acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) e outras induz fenômenos de peroxidação lipídica e glicoxidação culminando na formação de produtos finais avançados de lipoxidação e glicação (ALEs e AGEs, respectivamente). ALEs e AGEs podem se ligar a proteínas, causando anormalidades funcionais e estruturais, e também influenciar a sinalização celular ativando, entre outras, vias de morte [5,6].

O estado redox e os níveis de glicação desfavoráveis ​​estão ligados ao envelhecimento, doenças degenerativas e danos vasculares acumulados em certas subpopulações, particularmente pacientes com diabetes mellitus (DM). Entretanto, pouco se sabe sobre a influência da glicação e glicoxidação do sistema antioxidante na biomecânica arterial e no desenvolvimento de danos a órgãos-alvo em pacientes aparentemente saudáveis ​​com RCV moderada a alta. Nosso objetivo é estudar a relação específica entre anormalidades biomecânicas arteriais e TOD com níveis séricos de glicação, estado de glicoxidação e equilíbrio função-estrutura de alguns elementos do sistema antioxidante, destacando catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase [4,7,8].

MATERIAIS E MÉTODOS

Design e configuração do projeto

Este é um projeto observacional, ambispectivo e multicêntrico promovido pela Unidade de Hipertensão e Risco Cardiovascular pertencente ao Serviço de Medicina Interna do Hospital Universitário de Santiago de Compostela. Os pacientes candidatos serão indivíduos pertencentes à Estrutura Organizacional de Gestão Integrada (EOXI) de Santiago de Compostela e Barbanza que procuram consulta para diagnóstico, gestão e acompanhamento de risco cardiovascular [9].

Participantes. Critérios de inclusão e exclusão

Do conjunto total de pacientes consultados, apenas serão pré-selecionados indivíduos maiores de 18 anos com perfil de risco cardiovascular moderado a alto de RCV com base nas pontuações de referência das diretrizes. Os critérios de exclusão incluirão a presença de DM de acordo com as diretrizes de prática clínica atuais, hábito de fumar (definido como consumo atual e nos 6 meses anteriores ao recrutamento), consumo de álcool de risco (definido como consumo superior a 10 g e 20 g diários para mulheres e homens , respectivamente) e doença cardiovascular estabelecida [10-14].

Avaliação de marcadores biomecânicos arteriais e TOD

Realizaremos exploração ultrassonográfica bilateral da Artéria Carótida Comum (ACC), Artéria Carótida Interna (ACI) e artérias distais dos membros inferiores utilizando um aparelho Mindray Z60 (Mindray®, Guangdong, China) com sonda de alta frequência. As seguintes medidas e cálculos serão extraídos:

1. No modo de movimento (modo M), medição concomitante do rádio arterial, das pressões arteriais e da espessura total da parede para cálculo dos parâmetros de distensibilidade e tensão no segmento médio da ACC [15,16].
2. No modo bidimensional (modo B), medição automatizada da espessura médio-intimal (IMT) na região distal do CCA, juntamente com detecção e caracterização de placa de colesterol [17].
3. No modo Doppler espectral, descrição morfológica da função volume-tempo (fluxo) em termos de velocidades de fluxo e índices de resistência vascular no segmento médio da CCA e ICA [18].
4. No modo B com módulo de elastografia, avaliação direta do grau de rigidez local em um segmento médio do CCA [19].
5. No modo Doppler espectral com sincronização de ECG, avaliação da velocidade da onda de pulso carotídeo-femoral (cf VOP) [20].
6. No modo Doppler espectral, avaliação do índice tornozelo-braquial (ITB) [21].

Também avaliaremos danos incipientes na microvasculatura retiniana por meio de retinografia com aparelho Topcon TRC-NW6S (Electronics®, Tóquio, Japão).

Avaliação de marcadores de estresse oxidativo e estrutura de atividade do sistema antioxidante

Para avaliar o status redox, os níveis de oxidação lipídica (peroxidação lipídica) e proteínas no plasma e na urina serão determinados pela quantificação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e tióis reduzidos, respectivamente, de acordo com os protocolos referenciados [22,23]. Ambos os métodos permitem a quantificação através de métodos espectrofotométricos. As análises serão realizadas em analisador Asys UVM-340 (Biochrom®, Cambridge, UK). A função enzimática da glutationa peroxidase, catalase e superóxido dismutase será medida como atividade enzimática com um analisador Asys UVM-340 (Biochrom®, Cambridge, UK) de acordo com os protocolos referenciados [24,25]. As características estruturais das enzimas antioxidantes baseadas nos padrões de glicação e glicoxidação serão avaliadas usando proteômica, incluindo SDS-PAGE, cromatografia e espectrometria de massa [26–28].

Determinação do status de glicação e glicoxidação

A porcentagem de hemoglobina glicada será avaliada por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com o próximo analisador de hemoglobina (A. Menarini Diagnostics®, Florença, Itália). Os níveis de frutosamina serão determinados pelo método enzimático da proteína sérica glicada diazima (Diazyme, Kent, Reino Unido) em um analisador Advia 2400 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.®, Tarrytown, EUA). A porcentagem de albumina glicada será estimada a partir dos níveis de frutosamina e albumina [29,30]. Esta avaliação laboratorial será realizada pelo Departamento de Laboratório do Hospital Central.

Os níveis gerais de glicoxidação serão quantificados pela determinação de produtos finais de glicação avançada (AGEs) na pele usando um AGE Reader (DiagnOptics BV®, Groningen, Holanda). Os AGEs representam principalmente adutos glicados ligados a proteínas que surgem durante os processos de glicoxidação. O AGE Reader foi desenvolvido para avaliar a autofluorescência da pele (SAF) de forma não invasiva, usando as propriedades fluorescentes de vários AGEs [31].

Resultados em risco cardiovascular

Mediremos o número necessário para tratar (NNT) de consultas e o tempo de exploração para detectar anormalidades na biomecânica arterial e danos em órgãos-alvo (TOD), e assim determinar um aumento do RCV que justifique a intensificação terapêutica. Eventos cardiovasculares e cerebrovasculares, internações hospitalares, consultas, óbito e incapacidade também serão avaliados [32].

Considerações Éticas e Boas Práticas Clínicas

Este estudo será conduzido de acordo com os princípios éticos da Declaração de Helsinque e os padrões de boas práticas na pesquisa do Serviço de Saúde Galego (Espanha) (SERGAS). O consentimento informado por escrito será obtido de todos os pacientes que concordaram em participar. Os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa de Santiago-Lugo (códigos 2021/401 e 2023/302).

Plano de Trabalho e Fluxo do Projeto

Numa primeira fase, pretendemos incluir pacientes que atendam aos critérios e consentam em participar. A avaliação clínico-antropométrica, a biomecânica arterial, a detecção de TOD e a coleta de amostras serão realizadas em um único ato médico. Marcadores biomecânicos, de estresse oxidativo, glicação e glicoxidação serão quantificados em pacientes com e sem anormalidades biomecânicas e TOD arterial. O objetivo desta fase é avaliar as diferenças entre grupos de pacientes com base em parâmetros biomecânicos e TOD arterial. Em um subgrupo de pacientes, também serão avaliadas diferenças na estrutura-função das enzimas antioxidantes em termos de níveis de glicação e glicoxidação, e sua relação com anormalidades biomecânicas arteriais e TOD. Esta fase incluirá a extração, coleta, processamento e análise de dados preliminares, juntamente com a obtenção dos resultados iniciais do projeto.

Numa segunda fase,

1. Pacientes sem anormalidades biomecânicas ou TOD serão submetidos a um acompanhamento de 5 anos, com avaliações anuais e finais de anormalidades biomecânicas, TOD e desfechos cardiovasculares. O objetivo desta fase é avaliar as diferenças nos marcadores anteriores entre grupos de pacientes com base em parâmetros biomecânicos e TOD arterial. Em um subgrupo de pacientes, também serão avaliadas diferenças na estrutura-função das enzimas antioxidantes em termos de níveis de glicação e glicoxidação, e sua relação com anormalidades biomecânicas arteriais e TOD. Esta fase incluirá a extração, coleta, processamento e análise de dados preliminares, juntamente com a obtenção dos resultados finais do projeto.
2. Pacientes com anormalidades biomecânicas e/ou TOD serão submetidos a um acompanhamento de 5 anos, com avaliações anuais e finais da progressão do TOD e desfechos cardiovasculares. O objetivo desta fase é avaliar as diferenças nos marcadores anteriores entre grupos de pacientes com base no TOD arterial e nos resultados cardiovasculares. Em um subgrupo de pacientes, serão avaliadas diferenças na estrutura-função das enzimas antioxidantes em termos de níveis de glicação e glicoxidação, e sua relação com TOD e desfechos cardiovasculares. Esta fase incluirá a extração, coleta, processamento e análise de dados preliminares, juntamente com a obtenção dos resultados finais do projeto.

Análise matemática e modelagem

O pacote de software estatístico SPSS 22.0 (SPSS Inc.®, Chicago, IL, EE.UU) será empregado. Será realizada abordagem estatística descritiva, incluindo avaliação de normalidade para variáveis ​​quantitativas. Estatísticas univariadas serão utilizadas para comparar grupos com testes específicos dependendo do tipo de variável. Caso sejam encontrados resultados relevantes, serão realizados estudos de correlação linear. Após análise univariada, serão construídos modelos multivariados, tanto explicativos para a associação dos preditores com os desfechos, quanto preditivos para o risco de alterações biomecânicas, TOD e resultados cardiovasculares. Para avaliar fatores que podem influenciar parâmetros biomecânicos, TOD e resultados cardiovasculares ao longo do tempo, serão aplicados procedimentos matemáticos específicos relacionados à abordagem de modelagem articular e análise de séries temporais. Os cálculos do tamanho da amostra serão baseados em testes estatísticos específicos de acordo com o tipo e distribuição da variável, considerando sempre tamanho de efeito moderado, intervalo de confiança de 95% (IC95%) e poder mínimo de 80% [33-35].

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